ข่าว

ขอบคุณสำหรับการเยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันของเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้ได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงผลไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
เซลล์มะเร็งได้พัฒนากลไกต่างๆ เพื่อเอาชนะความเครียดของเซลล์และก้าวหน้าต่อไปโปรตีน kinase R (PKR) และตัวกระตุ้นโปรตีน (PACT) เป็นตัวตอบสนองเริ่มต้นที่ติดตามสัญญาณความเครียดต่างๆ ที่นำไปสู่การยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์และการตายของเซลล์อย่างไรก็ตาม กฎระเบียบของวิถี PACT-PKR ในเซลล์มะเร็งยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดที่นี่ เราพบว่า RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาว (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) มีส่วนเกี่ยวข้องโดยตรงในการยับยั้งวิถี PACT-PKR และส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งด้วยการใช้การตรวจคัดกรองเชิงฟังก์ชันขนาดใหญ่ของ lncRNA ที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง CRISPRi 971 เราพบว่า DARS-AS1 มีความเกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งอย่างมีนัยสำคัญดังนั้นการทำให้ล้มลงของ DARS-AS1 ยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์และส่งเสริมการตายของเซลล์มะเร็งในเซลล์มะเร็งชนิดต่างๆ ในหลอดทดลอง และลดการเติบโตของเนื้องอกในร่างกายอย่างมีนัยสำคัญในทางกลไก DARS-AS1 จะจับโดยตรงกับโดเมนการเปิดใช้งาน PACT และป้องกันการโต้ตอบ PACT-PKR ซึ่งจะช่วยลดการกระตุ้น PKR, eIF2α phosphorylation และยับยั้งการตายของเซลล์ apoptoticในทางการแพทย์ DARS-AS1 แสดงออกอย่างกว้างขวางในมะเร็งหลายชนิด และการแสดงออกมากเกินไปของ lncRNA นี้บ่งบอกถึงการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีการศึกษานี้อธิบายกฎเกณฑ์จำเพาะมะเร็งของวิถี PACT-PKR โดย DARS-AS1 lncRNA และให้เป้าหมายอื่นสำหรับการพยากรณ์และการรักษามะเร็ง
ความสามารถในการปรับตัวให้เข้ากับความเครียดเป็นลักษณะสำคัญของการอยู่รอดและการเพิ่มจำนวนของเซลล์มะเร็งการแพร่กระจายอย่างรวดเร็วและลักษณะเฉพาะของการเผาผลาญของมะเร็งจะถึงจุดสูงสุดในสภาพแวดล้อมจุลภาคที่รุนแรง เช่น การขาดสารอาหาร ขาดออกซิเจน และ pH ต่ำ ซึ่งสามารถกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณการตายของเซลล์การควบคุมยีนที่ไวต่อความเครียด เช่น p535 โปรตีนช็อตจากความร้อน 6, 7, KRAS8, 9 และ HIF-110, 11, 12, 13 มักพบในมะเร็ง ซึ่งขัดขวางการตายของเซลล์และส่งเสริมการอยู่รอด
โปรตีน kinase R (PKR) เป็นเซ็นเซอร์ความเครียดที่สำคัญและไคเนสของหน่วยย่อยของปัจจัยการเริ่มต้นยูคาริโอต 2α (eIF2α) ซึ่งเป็นตัวควบคุมการแปลที่เชื่อมโยงความเครียดของเซลล์กับการตายของเซลล์เดิมที PKR ถูกระบุว่าเป็นโปรตีนต้านไวรัสโดยการตรวจจับ RNA สองสายจากต่างประเทศ (dsRNA)เมื่อกระตุ้น PKR phosphorylates eIF2α จะยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนจากไวรัสและเซลล์14,15,16PACT (โปรตีนตัวกระตุ้น PKR) ได้รับการระบุว่าเป็นโปรตีนตัวกระตุ้น PKR ตัวแรกในกรณีที่ไม่มี dsRNA17,18,19,20,21,22,23ด้วยการโต้ตอบโดยตรงกับ PKR PACT จะแปลงความเครียดต่างๆ (การอดอาหารในซีรั่ม เปอร์ออกไซด์หรือการบำบัดด้วยอาร์เซไนต์) ไปยัง PKR และเส้นทางการส่งสัญญาณที่ปลายน้ำนอกจาก eIF2α phosphorylation แล้ว การเปิดใช้งาน PKR ที่ใช้ PACT จะกระตุ้นเหตุการณ์ต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อความเครียด รวมถึงสถานะรีดอกซ์ที่เปลี่ยนแปลงผ่านวิถีทาง PI3K/Akt24 การตรวจสอบความเสียหายของ DNA ที่ได้รับการปรับปรุงผ่าน p5325,26 และ NF-κB27,28 ควบคุมการถอดรหัส 29 เนื่องจากมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองต่อความเครียด การเพิ่มจำนวน การตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิส และกระบวนการสำคัญอื่นๆ ของเซลล์ PKR และ PACT จึงเป็นเป้าหมายในการรักษาสำหรับโรคต่างๆ โดยเฉพาะมะเร็ง 30,31,32,33อย่างไรก็ตาม แม้จะมีนัยสำคัญทางหน้าที่และทางชีวภาพของ pleiotropic นี้ การควบคุมกิจกรรม PACT/PKR ในเซลล์มะเร็งยังคงเข้าใจยาก
lncRNAs เป็นการถอดเสียงที่มีขนาดใหญ่กว่า 200 นิวคลีโอไทด์ที่ไม่มีศักยภาพในการเข้ารหัสโปรตีนเนื่องจากโครงการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดล้ำสมัยได้ระบุ lncRNAs หลายพันตัว จึงได้ใช้ความพยายามอย่างมาก 35,36 เพื่อชี้แจงหน้าที่ทางชีววิทยาของพวกมันการวิจัยที่เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่า lncRNAs เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาหลายอย่าง37 รวมถึงการควบคุมการหยุดทำงานของโครโมโซม X38,39, การประทับ 40, การถอดรหัส 41,42, การแปล 43 และแม้กระทั่งการเติบโตของมะเร็ง44,45,46,47การศึกษาเหล่านี้รายงานว่า lncRNAs จำนวนมากเกี่ยวข้องกับเส้นทาง PACT/PKRหนึ่งการศึกษาดังกล่าวแสดงให้เห็นว่า lncRNA ASPACT ยับยั้งการถอดรหัส PACT และเพิ่มการกักเก็บนิวเคลียร์ของ PACT mRNAการศึกษาอื่น ๆ แสดงให้เห็นว่า lncRNA nc886 จับกับ PKR และยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นของมัน 49,50จนถึงตอนนี้ ยังไม่มีการรายงาน lncRNA ที่ควบคุมการเปิดใช้งาน PKR ที่อาศัย PACT
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ถูกระบุว่าเป็น lncRNA51,52,53,54 ที่ก่อมะเร็งด้วยการควบคุมของ miP-194-5p53, miP-12952 และ miP-532-3p51 DARS-AS1 ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าส่งเสริมการเติบโตของเซลล์มะเร็งไตที่ชัดเจน มะเร็งต่อมไทรอยด์ และมะเร็งปอดที่ไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก ตามลำดับTong และคณะยังพบว่า DARS-AS1 ส่งเสริมความก้าวหน้าของ myeloma โดยคงความเสถียรของโปรตีน 39 (RBM39) RNA-binding motifอย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการศึกษาว่า lncRNA นี้เกี่ยวข้องกับการควบคุมการกระตุ้น PACT-PKR และการตอบสนองต่อความเครียดของเซลล์มะเร็งหรือไม่
ในที่นี้ เราดำเนินการหน้าจอขนาดใหญ่ที่สูญเสียการทำงานโดยใช้ระบบ CRISPRi และพิจารณาว่า DARS-AS1 lncRNA ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเซลล์มะเร็งหลายประเภทนอกจากนี้ เราได้ระบุกลไกสำคัญ: DARS-AS1 จับกับ PACT โดยตรง ยับยั้งการจับ PACT และ PKR ป้องกันฟอสโฟรีเลชันของ eIF2α ซึ่งเป็นสารตั้งต้น PKR ที่ต่ำกว่า และยับยั้งการตายของเซลล์ apoptotic ในท้ายที่สุดโดยสรุป งานของเราเผยให้เห็น DARS-AS1 lncRNA ในฐานะผู้ควบคุมเส้นทาง PACT-PKR และเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการรักษามะเร็งและการพยากรณ์โรค
การศึกษาโปรไฟล์จีโนมอย่างกว้างขวางได้ระบุ lncRNAs หลายร้อยรายการที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งอย่างไรก็ตาม หน้าที่ของพวกมันยังคงไม่เป็นที่รู้จักมากนัก56ในการระบุผู้สมัครที่มีแนวโน้มว่าจะเป็น lncRNA ที่เกี่ยวข้องกับการลุกลามของมะเร็ง เราได้ทำการตรวจคัดกรองการสูญเสียการทำงานเพื่อลดการเพิ่มจำนวนในเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก SW620 โดยใช้ระบบ CRISPRi (รูปที่ 1a)ลักษณะเฉพาะของสายพันธุ์ของเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ SW480 และ SW620 คือพวกมันได้มาจากเนื้องอกปฐมภูมิและทุติยภูมิในผู้ป่วยรายเดียวนี่เป็นการเปรียบเทียบที่มีคุณค่าสำหรับการศึกษาการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในการลุกลามของมะเร็งลำไส้ใหญ่ขั้นสูงดังนั้นเราจึงวิเคราะห์ทรานสคริปต์ของสายเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก (SW480 และ SW620) โดยใช้การจัดลำดับอาร์เอ็นเอและรวบรวม lncRNA ที่ใช้งานได้บางส่วนจากเอกสารที่ตีพิมพ์จากผลลัพธ์เหล่านี้ เราออกแบบไลบรารี sgRNA แบบรวมกลุ่มที่มี 7355 sgRNA oligos ที่กำหนดเป้าหมายไปยัง lncRNA ที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง 971 ตัว และ sgRNA oligos ที่ไม่ตรงเป้าหมาย 500 ตัวสำหรับกลุ่มควบคุมเชิงลบ (ข้อมูลเสริม 1)
แผนผังแสดงการคัดกรองโดยใช้ระบบ CRISPRiการเสริมสมรรถนะ b sgRNA หลังการตรวจคัดกรองเส้นประแนวนอนแสดงถึง log2 (การเปลี่ยนแปลงการพับ) = ±0.58เส้นประแนวตั้งระบุค่า p = 0.05จุดสีดำแสดงถึง sgRNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย (กำหนดเป็น NC)จุดสีแดงคือ sgRNA ที่กำหนดเป้าหมายไปที่ DARS-AS1จุดสีน้ำเงินคือ sgRNA ที่กำหนดเป้าหมายไปที่ LINC00205 ซึ่งเป็น lncRNA ที่ก่อให้เกิดมะเร็งที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้การเปลี่ยนแปลงการพับ = (การอ่านปกติ วันที่ 17)/(การอ่านค่าปกติ วันที่ 0)c DARS-AS1 sgRNA น็อคดาวน์ยับยั้งการเติบโตของเซลล์แถบข้อผิดพลาดแสดงถึง±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการทดลองทั้งสาม* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้านd การแสดงออกของ DARS-AS1 ในเนื้องอก (ชุดข้อมูล TCGA)การแสดงออกของ DARS-AS1 ในตัวอย่างปกติและตัวอย่างเนื้องอกที่จับคู่กันจากผู้ป่วยที่มี BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP และ COAD ตามลำดับ (ชุดข้อมูล TCGA)ได้ค่า p โดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน
หลังจากสร้างพลาสมิดและบรรจุไวรัสเลนติไวรัส เราได้แปลงเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ dCas9-SW620 กับคลังด้านบนในการทดลองการติดเชื้ออิสระสี่ครั้งการติดเชื้อหลายหลาก (MOI) สำหรับการติดเชื้อเหล่านี้คือ 0.1–0.3 ซึ่งบ่งชี้ว่าแต่ละเซลล์สามารถทรานส์เฟกได้ด้วย sgRNA เดียวเท่านั้นหลังจาก 18 วันของการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง โปรไฟล์การเสริมสมรรถนะของ sgRNA เป้าหมายลดลงหรือเพิ่มขึ้นหลังการตรวจคัดกรอง ในขณะที่จำนวนของโอลิโกนิวคลีโอไทด์กลุ่มควบคุมที่ไม่ได้กำหนดเป้าหมายยังคงค่อนข้างไม่เปลี่ยนแปลงเมื่อเทียบกับโปรไฟล์ก่อนการคัดกรอง ซึ่งบ่งชี้ว่าเป้าหมายของเรามีความเฉพาะเจาะจงกับหน้าจอสูง ห้องสมุด.ข้าว.1b และตารางเสริม 1). LINC00205 ซึ่งก่อนหน้านี้มีรายงานว่าส่งเสริมมะเร็งปอดและความก้าวหน้าของมะเร็งตับ 58,59,60 ถูกคัดออก (log2 (การเปลี่ยนแปลงการพับ) < −0.58 ค่า p < 0.05) ซึ่งยืนยันความน่าเชื่อถือของการตรวจคัดกรองนี้ (รูปที่ 1b) LINC00205 ซึ่งก่อนหน้านี้มีรายงานว่าส่งเสริมมะเร็งปอดและความก้าวหน้าของมะเร็งตับ 58,59,60 ถูกคัดออก (log2 (การเปลี่ยนแปลงการพับ) < −0.58 ค่า p < 0.05) ซึ่งยืนยันความน่าเชื่อถือของการตรวจคัดกรองนี้ (รูปที่ 1b) LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1ข). ไม่รวม LINC00205 ซึ่งรายงานก่อนหน้านี้เพื่อส่งเสริมการลุกลามของมะเร็งปอดและมะเร็งตับ 58,59,60 (บันทึก 2 (การเปลี่ยนแปลงเท่า) <-0.58 ค่า p <0.05) ซึ่งยืนยันความทนทานของการตรวจคัดกรองนี้ (รูปที่ .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1ข). ไม่รวม LINC00205 ที่รายงานก่อนหน้านี้เพื่อส่งเสริมความก้าวหน้าของมะเร็งปอดและตับ 58,59,60 (บันทึก 2 (การเปลี่ยนแปลงเท่า) <-0.58 ค่า p <0.05) ซึ่งยืนยันความทนทานของการตรวจคัดกรองนี้ (รูปที่ .1b)
ในบรรดา lncRNAs ที่ทดสอบทั้งหมด DARS-AS1 ยังถูกคัดกรองด้วย โดยสาม sgRNA oligonucleotides ที่เชื่อมโยงกันลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากเพาะเลี้ยง 18 วัน ซึ่งบ่งชี้ว่าการล้มลงของ lncRNA นี้ส่งผลให้การแพร่กระจายของมะเร็งลดลง (รูปที่ 1b)ผลลัพธ์นี้ได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดยการวิเคราะห์ MTS ในเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักซึ่งแสดงให้เห็นว่าอัตราการเติบโตของเซลล์ล้มลง DARS-AS1 นั้นลดลงเพียงครึ่งหนึ่งเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุม (รูปที่ 1c) และสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้าของมะเร็งหลายชนิดอื่นๆ: มะเร็งไตชนิดเซลล์ใส มะเร็งต่อมไทรอยด์ และมะเร็งปอดชนิดเซลล์ไม่เล็ก51,52,53,55อย่างไรก็ตาม หน้าที่และกลไกของโมเลกุลในมะเร็งลำไส้ใหญ่ยังคงไม่ถูกสำรวจดังนั้นเราจึงเลือก lncRNA นี้เพื่อการศึกษาต่อไป
เพื่อศึกษาการแสดงออกของ DARS-AS1 ในผู้ป่วย เราได้วิเคราะห์ตัวอย่างเนื้องอก 10,327 ตัวอย่างจากโครงการ Cancer Genome Atlas (TCGA) อย่างครอบคลุมผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า DARS-AS1 แสดงออกอย่างกว้างขวางและได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ที่มีสุขภาพดีในเนื้องอกต่างๆ รวมถึงมะเร็งลำไส้ (COAD) มะเร็งเซลล์ใสในไต (KIRC) และมะเร็งเซลล์พาพิลลารีในไต (KIRP).น้อยมาก (รูปที่ 1d และรูปที่ 1a, b) เพิ่มเติม การวิเคราะห์คู่ตัวอย่างที่มีสุขภาพดี/เนื้องอกยืนยันการแสดงออกของ DARS-AS1 ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้องอกของมะเร็งกระเพาะปัสสาวะ urothelial carcinoma (BLCA), มะเร็งเซลล์ไตใสในไต (KIRC), มะเร็งต่อมลูกหมาก (PRAD), มะเร็งปอด squamous cell carcinoma (LUSC) , มะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูกในมดลูก (UCEC), มะเร็งต่อมน้ำเหลืองในปอด (LUAD), มะเร็งตับตับ (LIHC), มะเร็งเซลล์เยื่อบุโพรงมดลูกในไต (KIRP) และมะเร็งลำไส้ใหญ่ (COAD) (ค่า p < 0.05) (รูปที่ 1e–m) . การวิเคราะห์คู่ตัวอย่างที่มีสุขภาพดี/เนื้องอกยืนยันการแสดงออกของ DARS-AS1 ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้องอกของมะเร็งกระเพาะปัสสาวะ urothelial carcinoma (BLCA), มะเร็งเซลล์ไตใสในไต (KIRC), มะเร็งต่อมลูกหมาก (PRAD), มะเร็งปอด squamous cell carcinoma (LUSC) , มะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูกในมดลูก (UCEC), มะเร็งต่อมน้ำเหลืองในปอด (LUAD), มะเร็งตับตับ (LIHC), มะเร็งเซลล์เยื่อบุโพรงมดลูกในไต (KIRP) และมะเร็งลำไส้ใหญ่ (COAD) (ค่า p < 0.05) (รูปที่ 1e–m) .การวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีสุขภาพดี/เนื้องอกที่จับคู่กันยังยืนยันการแสดงออกของ DARS-AS1 ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในมะเร็งกระเพาะปัสสาวะมะเร็งท่อปัสสาวะ (BLCA), เซลล์ไตที่ชัดเจนและมะเร็งเซลล์ไต (KIRC), มะเร็งต่อมลูกหมาก (PRAD), เนื้องอกเซลล์มะเร็งปอด squamous (LUSC), карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– ม.) , มะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูกของ corpus uteri (UCEC), มะเร็งต่อมน้ำเหลืองในปอด (LUAD), มะเร็งตับในตับ (LIHC), มะเร็งเซลล์ papillary ของไต (KIRP) และมะเร็งลำไส้ของลำไส้ใหญ่ (COAD) (ค่า p < 0.05) (รูปที่ 1e– ม.) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着更高表达，子宫体子宫内膜癌（UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值） <0.05）（图1e-m） .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .การวิเคราะห์ตัวอย่างที่จับคู่ที่มีสุขภาพดี/เนื้องอกสนับสนุนบทบาทของ DARS-AS1 ในมะเร็งกระเพาะปัสสาวะมะเร็งท่อปัสสาวะ (BLCA), มะเร็งเซลล์ไตที่ชัดเจน (KIRC), มะเร็งต่อมลูกหมาก (PRAD) และมะเร็งปอด squamous cell carcinoma (LUSC)экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -ม.) การแสดงออกในคอร์ปัสมดลูกคาร์ซิโนมา (UCEC), มะเร็งต่อมอะดีโนคาร์ซิโนมา (LUAD), มะเร็งตับ (LIHC), มะเร็งเซลล์เยื่อบุโพรงมดลูก (KIRP) และมะเร็งลำไส้ (COAD) (ค่า p <0.05) (รูปที่ 1e -m)เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า DARS-AS1 แสดงออกอย่างกว้างขวางและสูงในมะเร็งหลายชนิด
เนื่องจาก DARS-AS1 และ DARS (ยีนที่เข้ารหัสสายแอนติเซนส์) มีโปรโมเตอร์เดียวกันและตั้งอยู่ติดกัน เราจึงออกแบบ shRNA ให้ล้มลงโดยเฉพาะ DARS-AS1 แต่ไม่ใช่ DARS (รูปที่ 2a,b เสริมและตารางเสริมที่ 2 ) .นอกจาก SW620 แล้ว เรายังใช้เซลล์อีกสามสายพันธุ์ที่แสดงออกถึง DARS-AS1 อย่างมากเพื่อศึกษาประสิทธิภาพและหน้าที่ของการล้มลงของ shRNA (ตารางเสริมที่ 3)ผลลัพธ์ของเราระบุว่า shRNA ทั้งสามที่พัฒนาขึ้นนั้นมีประสิทธิภาพการล้มลงของ DARS-AS1 อย่างน้อย 80% โดยมีผลกระทบเพียงเล็กน้อยต่อปริมาณของ DARS mRNA (รูปที่ 2c–f เสริม)นอกจากนี้ เราพบว่าการล้มลงของ DARS-AS1 ด้วย shRNA เหล่านี้ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ในสายเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก SW620 (49.7%) และ HCT116 (27.7%) เซลล์มะเร็งเต้านมอย่างมีนัยสำคัญ MBA-MD-231 (53.4%)) และสายเซลล์มะเร็งตับ HepG2 (ลดลง 92.7%) รวมทั้งความสามารถในการสร้างทรงกลมที่ไม่มีการยึดเกาะ (การลดลงเฉลี่ย ~50.8%, 44.6%, 40.7% และ 75.7% ต่อสายเซลล์) (รูปที่ 2a,b)ใน SW620 ผลลัพธ์ของการทดสอบการก่อรูปโคโลนียืนยันเพิ่มเติมว่า DARS-AS1 shRNA ยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์อย่างมีนัยสำคัญด้วยการลดลงโดยเฉลี่ยประมาณ 69.6% (รูปที่ 2c)
ผลของ shRNA ควบคุมและ DARS-AS1 shRNA ต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์ (a) และการก่อรูปทรงกลม (b) ในเซลล์ SW620, HCT116, MBA-MD-231 และ HepG2c ผลของ shRNA ควบคุมและ DARS-AS1 shRNA ต่อการเกิดโคโลนีในเซลล์ SW620การเพิ่มจำนวนเซลล์ (d), การก่อรูปทรงกลม (e) และการก่อรูปโคโลนี (f) ของเซลล์ SW620 ซึ่งแสดงออก DARS-AS1 มากเกินไปข้อมูลที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการทดลองสามครั้ง* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 และ *** p ≤ 0.001 โดยการทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน
เพื่อเสริมการศึกษาการสูญเสียการทำงาน ต่อไปเราได้สร้างเซลล์ SW620 ที่แสดง DARS-AS1 มากเกินไป (รูปที่ 2g เสริม)การแสดงออกของ DARS-AS1 มากเกินไปทำให้การเติบโตของเซลล์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (1.8 เท่า), การก่อรูปทรงกลมที่ไม่ยึดเกาะ (1.4 เท่า) และการก่อรูปโคโลนี (3.3 เท่า) ในเซลล์ SW620 (รูปที่ 2d–f)เรายืนยันผลลัพธ์นี้โดยใช้สายเซลล์ที่แสดงออก DARS-AS1 อื่น A549การเพิ่มจำนวนเซลล์ที่เพิ่มขึ้นนี้เนื่องจากการแสดงออกมากเกินไปของ DARS-AS1 ถูกสังเกตเพิ่มเติมในเซลล์ A549 (รูปที่ 2 ชั่วโมง, i และตารางเพิ่มเติมที่ 3)เมื่อนำมารวมกัน การศึกษาการเพิ่มขึ้นและการสูญเสียเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า DARS-AS1 ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งในหลอดทดลอง
ในการสำรวจกลไกเบื้องหลังที่ DARS-AS1 ควบคุมการเพิ่มจำนวนเซลล์ เราได้ทำการวิเคราะห์ RNA แบบดึงลง เพื่อระบุพันธมิตรที่มีผลผูกพันโปรตีนที่เป็นไปได้ผลลัพธ์ของ RT-qPCR แสดงให้เห็นว่าประมาณ 86.2% ของ DARS-AS1 ตั้งอยู่ในไซโตพลาสซึมของเซลล์ SW620 (รูปที่ 3a เสริม)จากนั้น DARS-AS1 หรือ pseudoRNA ที่คัดลอกโดย biotinylated ในหลอดทดลอง ถูกบ่มด้วยเซลล์ไลเซต SW620 ตามด้วยการแยก SDS-PAGEการย้อมสีเงินที่ตามมาแสดงให้เห็นว่าแถบที่ชัดเจน (~38 kDa) ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างการดึง DARS-AS1 แต่ไม่พบในตัวอย่าง RNA จำลองหรือลูกปัด (รูปที่ 3a)แถบนี้ถูกระบุว่าเป็นโปรตีนกระตุ้น PKR (PACT) โดยแมสสเปกโตรเมทรี (MS) และยืนยันเพิ่มเติมโดยอิมมูโนบล็อตติงในสายพันธุ์ของเซลล์ SW620, HCT116 และ HepG2 (รูปที่ 3a,b)การเพิ่มคุณค่าของ DARS และโปรตีน PACT ที่เกี่ยวข้อง - PKR และ TRBP - ยังได้รับการตรวจสอบโดยใช้การวิเคราะห์ RNA โดย Western blotting (WB)ผลการวิจัยพบว่าไม่มีปฏิสัมพันธ์โดยตรงระหว่าง DARS-AS1 RNA กับโปรตีนทั้งสามชนิดนี้ (รูปที่ 3b เสริม)ปฏิสัมพันธ์เฉพาะระหว่าง DARS-AS1 และ PACT ได้รับการยืนยันเพิ่มเติมโดยการวิเคราะห์ RNA immunoprecipitation (RIP) ซึ่งแสดงให้เห็นว่า DARS-AS1 ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญในแอนติบอดีต่อต้าน PACT แต่ไม่ใช่ RNA ควบคุมอื่น ๆ (รูปที่ 3c)เพื่อตรวจสอบว่า DARS-AS1 มีปฏิสัมพันธ์โดยตรงกับ PACT ในกรณีที่ไม่มีส่วนประกอบของเซลล์อื่นๆ หรือไม่ การทดสอบในหลอดทดลอง biolayer interferometry (BLI) ได้ดำเนินการโดยใช้ PACT ที่บริสุทธิ์DARS-AS1 ที่ติดฉลากไบโอตินหรือ RNA จำลอง ถูกตรึงบนไบโอเซนเซอร์สเตรปทาวิดิน (SA) จากนั้นจึงฟักไข่ในบัฟเฟอร์จลนศาสตร์ที่มี 1 ไมโครโมลาร์ PACTโดยเฉพาะอย่างยิ่ง PACT ผูกมัดอย่างแน่นหนากับ DARS-AS1 (ค่า KD ~26.9 นาโนโมลาร์) แต่ไม่ใช่เพื่อเลียนแบบ RNA (รูปที่ 3d)เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงปฏิสัมพันธ์โดยตรงและความสัมพันธ์สูงระหว่าง DARS-AS1 และ PACT
การวิเคราะห์ RNA pull ระบุ DARS-AS1 ที่โต้ตอบกับ PACT ในเซลล์ SW620ด้านบน การย้อมสีเงินของโปรตีนที่เกี่ยวข้องอิมมูโนบลอตที่ต่ำกว่าถูกดำเนินการด้วยแอนติบอดีต้าน PACTb การวิเคราะห์แบบดึงลงของ RNA ถูกดำเนินการในเซลล์ HCT116 (บนสุด) และ HepG2 (ด้านล่าง)ตรวจพบการเสริมสมรรถนะของ PACT โดย immunoblottingการสอบวิเคราะห์ cRNA immunoprecipitation (RIP) ถูกดำเนินการในเซลล์ SW620 โดยใช้แอนติบอดีที่ระบุd เส้นโค้งการจับ PACT กับ DARS-AS1 แบบเต็มความยาวหรือ RNA ควบคุมได้มาจากการใช้ biolayer interferometry (BLI)RNA ถูกตรึงบนไบโอเซนเซอร์สเตรปทาวิดิน1 μM PACT ถูกใช้เพื่อวัดความสัมพันธ์การทดสอบดึง RNA ของ e ดำเนินการโดยใช้ DARS-AS1 แบบเต็มความยาวไบโอตินหรือตัดปลาย (บนสุด)Immunoblot แสดง PACT ที่ได้รับ (ด้านล่าง)f PACT ที่ถูกตั้งค่าสถานะให้บริสุทธิ์ถูกบ่มด้วย DARS-AS1 แบบเต็มความยาวที่เติมไบโอตินหรือตัดปลาย (ดังใน e) สำหรับการสอบวิเคราะห์ RIP ในหลอดทดลองRNA ที่สกัดออกมาถูกตรวจสอบโดย RT-qPCRg ความสัมพันธ์สัมพัทธ์ของชิ้นส่วน RNA ต่างๆ สำหรับ PACT ได้มาจากการใช้ biolayer interferometryสำหรับการวิเคราะห์ ใช้ 100 นาโนโมลาร์ RNA และ 1 ไมโครโมลาร์ RASTh การทดสอบ RIP ในหลอดทดลองถูกดำเนินการโดยใช้ PACT ที่ติดฉลากที่ยังไม่เสียหายหรือถูกตัดทอนให้บริสุทธิ์RNA ที่สกัดออกมาถูกตรวจสอบโดย RT-qPCRอัตราการเติบโตของเซลล์ SW620 แสดงออก DARS-AS1, PACT หรือทั้งสองอย่างมากเกินไปj การแสดงออกมากเกินไปของ DARS-AS1 แบบเต็มความยาวหรือที่ถูกตัดทอนในเซลล์ SW620 มีผลต่างกันต่อการเจริญเติบโตของเซลล์k อะพอพโทซิสถูกตรวจพบโดย immunoblotting ด้วยแอนติบอดีต่อต้าน PARPการทำให้ล้มลงของ DARS-AS1 ทำให้เกิดการตายของเซลล์ SW620 ตามที่แสดงโดยโฟลว์ไซโตเมทรีข้อมูลที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการทดลองสามครั้ง *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 โดยการทดสอบแบบสองทางของนักเรียน *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 โดยการทดสอบแบบสองทางของนักเรียน *p ≤ 0,05 **p ≤ 0,01 ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 โดยการทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 โดยการทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน
จากนั้นเราสร้างชิ้นส่วน DARS-AS1 RNA ที่เติมไบโอตินสามชิ้นโดยการถอดรหัสในหลอดทดลองเพื่อระบุภูมิภาค DARS-AS1 ที่จำเป็นสำหรับการเชื่อมโยง PACT (รูปที่ 3e)ผลการวิเคราะห์ RNA แสดงให้เห็นว่าแต่ละส่วนสามารถโต้ตอบกับ PACT ได้ แต่บริเวณปลาย 3′ (384–768 นิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลาก A3) แสดงนิวคลีโอไทด์มากกว่า 1–384 ที่มีป้ายกำกับ A1) (รูปที่ 3e)ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันถูกสังเกตพบในการสอบวิเคราะห์ RIP ในหลอดทดลอง โดยใช้ลูกผสม PACT (รูปที่ 3f)สอดคล้องกับผลลัพธ์เหล่านี้ การทดลองเพื่อจับชิ้นส่วนอาร์เอ็นเอที่ถูกตรึงไว้กับ PACT โดยใช้ BLI ยังแสดงให้เห็นว่า PACT มีความสัมพันธ์ที่สูงกว่าสำหรับ A3 (384–768 nt) (ค่า KD ประมาณ 94.6 nM) ในขณะที่แทบไม่มีการเชื่อมโยงกับพื้นที่อื่นๆ(รูปที่ 3d).
นอกจากนี้เรายังตรวจสอบขอบเขตการผูกที่เกี่ยวข้องใน PACTPACT ประกอบด้วยโดเมนที่ใช้งานได้สามโดเมน ซึ่งสองโดเมนเป็นโดเมนการจับ RNA แบบสองสายที่อนุรักษ์ไว้ (dsRBD) และโดเมนที่สาม (D3) ที่กำหนดซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นของปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนเพื่อตรวจสอบความสามารถในการจับ lncRNA ของแต่ละโดเมน เราได้ทำวิศวกรรมการกลายพันธุ์สามครั้งที่ลบแต่ละโดเมนออกจากสามโดเมน และทำการทดสอบ RIP ในหลอดทดลองผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการลบโดเมนที่สาม (D3) ของ PACT ลดการโต้ตอบกับ DARS-AS1 อย่างมีนัยสำคัญ (โดย 0.11 เท่าเมื่อเทียบกับ PACT ที่ไม่บุบสลาย) เมื่อเทียบกับการกลายพันธุ์อีกสองครั้ง (รูปที่ 3h) แสดงให้เห็นว่าการปล่อย ของ D3 โต้ตอบกับ DARS-AC1.เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่าง DARS-AS1 และ PACT อาจเกิดขึ้นโดยหลักผ่านจุดสิ้นสุด 3′ ของ DARS-AS1 และโดเมน D3 ของ PACT
เราสังเกตว่า DARS-AS1 ไม่มีผลต่อการแสดงออกของ PACT และ PACT ไม่มีผลต่อ DARS-AS1 (รูปที่ 3c เพิ่มเติม)จากนั้นเราตรวจสอบผลของการล้มลงของ PACT ต่อการเติบโตของเซลล์ตรงกันข้ามกับ DARS-AS1 เซลล์สัมพัทธ์เติบโตเร็วขึ้น 1.5–3 เท่าเมื่อ PACT ล้มลง (รูปที่ 3d เพิ่มเติม)ผลลัพธ์ของการสอบวิเคราะห์การก่อรูปโคโลนีบ่งชี้ว่าเซลล์ก่อรูปโคโลนี 2-3 เท่าหลังการบำบัดด้วย shRNA ด้วย PACT (รูปที่ 3e เสริม)เพื่อทดสอบว่า DARS-AS1 ควบคุมการเพิ่มจำนวนเซลล์ผ่าน PACT หรือไม่ เราจึงสร้างเซลล์ SW620 ที่แสดง PACT, DARS-AS1 หรือทั้งสองอย่างมากเกินไปการแสดงออกที่มากเกินไปของ PACT แสดงการยับยั้งที่มีนัยสำคัญของการเพิ่มจำนวนเซลล์ (รูปที่ 3i)ในขณะที่การแสดงออกมากเกินไปของ DARS-AS1 ต่อ se ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในอัตราการเติบโตของเซลล์ที่แสดง DARS-AS1 และ PACT มากเกินไปผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า PACT อาจต่อต้านการเพิ่มจำนวนที่เกิดจากการแสดงออกของ DARS-AS1 มากเกินไป
เนื่องจากภูมิภาคต่างๆ ของ DARS-AS1 มีความสามารถในการจับ PACT ที่แตกต่างกัน เราจึงตรวจสอบอิทธิพลสัมพัทธ์ที่มีต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์โดยการแสดงออกของชิ้นส่วน DARS-AS1 ที่มากเกินไปเมื่อเทียบกับอีกสองชิ้นส่วน DARS-AS1 มีการแสดงออกมากเกินไปที่ปลาย 3′ (384–768 nt) ซึ่งเป็นภูมิภาคที่เกี่ยวข้องกับ PACT หลักใน DARS-AS1 ซึ่งมีความสามารถสูงสุดในการกระตุ้นการเพิ่มจำนวนเซลล์ (รูปที่ 3j)ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ถึงความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างความสามารถในการจับกับหน้าที่ทางชีวภาพของ DARS-AS1
มีรายงานว่า PACT เป็นโปรตีนโปรอะพอพโทติก19ดังนั้นเราจึงตรวจสอบผลกระทบของ DARS-AS1 ต่อการตายของเซลล์ตามที่คาดไว้ การล้มลงของ DARS-AS1 ช่วยเพิ่มความแตกแยกของ PARP ในเซลล์ SW620 และเพิ่มสัดส่วนของเซลล์ annexin V-positive ในเซลล์ SW620, HCT116, HepG2 และ MBA-MD-231 (รูปที่ 3k)3).3f–h) ซึ่งบ่งชี้ว่าฤทธิ์ต้านอะพอพโทซิสของ DARS-AS1 ในเซลล์มะเร็งนั้นตรงกันข้ามกับหน้าที่กระตุ้นการตายของเซลล์ของ PACTเมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่ากลไกของฟังก์ชันก่อมะเร็งของ DARS-AS1 อาจเกิดจากการยับยั้งการทำงานของ PACT
ต่อไป เราสำรวจความหมายเชิงหน้าที่ของสมาคม DARS-AS1-PACTมีรายงาน PACT เพื่อกระตุ้น PKR ผ่านการโต้ตอบโดยตรง ซึ่งต่อมาช่วยเพิ่ม eIF2α phosphorylation ทำให้เกิดการลบการแปลและการตายของเซลล์อันดับแรก เราตรวจสอบว่า DARS-AS1 ส่งผลต่อการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ PACT และ PKR หรือไม่กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบคอนโฟคอลแสดงให้เห็นว่า PACT และ PKR ได้รับการจัดกลุ่มในเซลล์ SW620 ที่มีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เฉลี่ยของเพียร์สันที่ 0.72ในขณะเดียวกัน DARS-AS1 ที่แสดงออกมากเกินไปก็ลด PACT และ PKR co-localization ลงอย่างมีนัยสำคัญ (หมายถึงค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์แบบเพียร์สัน 0.61) (รูปที่ 4a)เพื่อตรวจสอบว่า DARS-AS1 สามารถปรับเปลี่ยนปฏิสัมพันธ์ของ PACT-PKR ได้หรือไม่ เราทำการทดสอบ co-immunoprecipitation (co-IP) ร่วมกับแอนติบอดีต้าน PACT ในเซลล์ SW620 ไลเซทPKR ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมากในสารต้าน PACT ในเซลล์ควบคุม ในขณะที่การฟื้นตัวของ PKR ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในไลเสตจากเซลล์ที่แสดงออก DARS-AS1 มากเกินไป (รูปที่ 4b)PACT และ PKR ที่ติดฉลากที่บริสุทธิ์ถูกใช้สำหรับการสอบวิเคราะห์การจับโปรตีน ในหลอดทดลองดังนั้น สิ่งเหล่านั้นที่ให้ DARS-AS1 แต่ไม่มี RNA ควบคุมแสดงการโต้ตอบ PACT-PKR ที่ถูกระงับ (รูปที่ 4c)ผลลัพธ์ทั้งหมดแสดงให้เห็นว่า DARS-AS1 ขัดขวางการสื่อสาร PACT และ PKR
การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ PACT และ PKR ในเซลล์ควบคุมหรือเซลล์ที่แสดงออก DARS-AS1 มากเกินไปถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงคอนโฟคอลนิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPIผลลัพธ์ทางสถิติได้มาจากภาพถ่าย 16 ภาพb Co-immunoprecipitation (co-IP) โดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน PACT ในเซลล์ไลเซทของเซลล์ควบคุม SW620 หรือเซลล์ที่แสดงออก DARS-AS1 มากเกินไปc ติดฉลาก PACT, PKR ที่บริสุทธิ์ และคัดลอก ในหลอดทดลอง ด้วย DARS-AS1 หรือ RNA จำลอง ถูกบ่มสำหรับการวิเคราะห์การจับโปรตีนในหลอดทดลองแอนติบอดีต่อต้านธงถูกใช้สำหรับการตกตะกอนภูมิคุ้มกันd อิมมูโนโบลต์ที่มีแอนติบอดีที่ระบุถูกดำเนินการในเซลล์ SW620 และ HCT116 ที่ทรานส์เฟกด้วย shRNA ควบคุมหรือ DARS-AS1-shRNA ตามด้วยภาวะอดอาหารในซีรัมe ระดับการแสดงออกของ DARS-AS1 เปลี่ยนความไวของเซลล์เป็น thapsigarginเซลล์ SW620 ถูกทรานส์เฟกด้วย DARS-AS1 shRNA, พลาสมิดที่แสดงออกมากเกินไปของ DARS-AS1 หรือพลาสมิดควบคุมเซลล์ถูกบำบัดด้วยแทปซิการ์กินเป็นเวลา 48 ชั่วโมงและความอยู่รอดของเซลล์ถูกกำหนดหาโดยใช้รีเอเจนต์ MTSฉ ในหลอดทดลอง คัดลอก DARS-AS1 หรือ RNA จำลอง และ PACT ที่บริสุทธิ์ ใช้สำหรับการทดสอบการกระตุ้นในหลอดทดลองและการตรวจจับอิมมูโนบล็อตg อิมมูโนโบล็อตที่ใช้แอนติบอดีเหล่านี้ถูกดำเนินการบนเซลล์ SW620-ctrl (ซ้าย) หรือเซลล์ที่แสดงการกลายพันธุ์ของ PKR มากเกินไป (ขวา)จากนั้นเซลล์เหล่านี้ถูกทรานส์เฟกด้วย shRNA ควบคุมหรือ DARS-AS1-shRNA ตามด้วยภาวะอดอาหารในซีรัมh Flow cytometry แสดงให้เห็นว่าการยับยั้งการกลายพันธุ์ PKR ชดเชยการตายของเซลล์ที่เกิดจาก DARS-AS1 ในเซลล์ SW620i อิมมูโนโบล็อตที่มีแอนติบอดีที่ระบุถูกดำเนินการในเซลล์ SW620 (ซ้าย) หรือ HCT116 (ขวา)เซลล์ที่ถ่ายด้วย shRNA ควบคุมหรือ DARS-AS1 shRNA นั้นไม่มีซีรั่มและเสริมด้วยตัวยับยั้ง PKR C16 100 nM หรือ DMSOแถบมาตราส่วน = 5 µmข้อมูลที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการทดลองสามครั้ง* p ≤ 0.05 การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน
เป็นที่เชื่อกันโดยทั่วไปว่าเมื่อ PACT มีปฏิสัมพันธ์กับ PKR17 สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดฟอสโฟรีเลชัน PKR ที่ Thr451 ได้ผลลัพธ์ของเราระบุว่าระดับของ PKR phosphorylation เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ที่ล้มลงของ DARS-AS1 หลังจากภาวะอดอาหารในซีรัม (รูปที่ 4d และรูปที่ 4a เพิ่มเติม)ดังนั้น เราพบว่าฟอสโฟรีเลชั่นของ eIF2α ซึ่งเป็นสารตั้งต้น PKR หลัก ก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญด้วย DARS-AS1 shRNA (รูปที่ 4d และรูปที่ 4a เพิ่มเติม)Thapsigargin เป็นตัวสร้างความเครียด ER ที่ทำให้ ER ปล่อย Ca2+มีรายงานการรักษาด้วย thapsigargin เพื่อกระตุ้นการแสดงออกและการกระตุ้น PACT ซึ่งโต้ตอบกับและกระตุ้น PKR ต่อไป ซึ่งนำไปสู่การตายของเซลล์โดยการเพิ่ม eIF2α phosphorylation 18,61ในที่นี้ เราใช้ thapsigargin เป็นตัวกระตุ้นเส้นทาง PACT/PKR เพื่อตรวจสอบว่า DARS-AS1 สามารถช่วยให้เซลล์เอาชนะความเครียดได้โดยการยับยั้งเส้นทาง PACT/PKR หรือไม่เราสังเกตว่าระดับการแสดงออกของ DARS-AS1 มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับความต้านทานของเซลล์ต่อ thapsigarginเซลล์ SW620 ที่แสดงอาการ DARS-AS1 มากเกินไปจะรอดชีวิตได้ดีกว่าเมื่อรักษาด้วยแทปซิการ์กิน ในขณะที่เซลล์ที่มีการล้มลงของ DARS-AS1 จะอ่อนแอกว่า (รูปที่ 4e)สอดคล้องกับผลลัพธ์เหล่านี้ การแสดงออกที่มากเกินไปของ DARS-AS1 ลดฟอสโฟรีเลชัน PKR ที่เกิดจาก thapsigargin (รูปที่ 4b เสริม)ในทางตรงกันข้าม หลังการรักษาด้วยแทปซิการ์กิน PKR และ eIF2α ถูกฟอสโฟรีเลตในระดับที่สูงขึ้นในเซลล์ที่ล้มลงของ DARS-AS1 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม (รูปที่ 4b เพิ่มเติม)ที่น่าสนใจคือ thapsigargin กระตุ้นการแสดงออกของ DARS-AS1 ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ซึ่งอาจบ่งชี้ถึงฟังก์ชันต่อต้านความเครียดของ DARS-AS1 (รูปที่ 4c เพิ่มเติม)นอกจากนี้ เรายังทำการทดสอบการเปิดใช้งานในหลอดทดลองเพื่อยืนยันการสังเกตเหล่านี้โดยสังเขป PKR ถูกทำให้บริสุทธิ์จากเซลล์ไลเซตโดยใช้แอนติบอดีต้าน PKR จากนั้นบ่มด้วยลูกผสม PACT และ DARS-AS1 ที่ถอดรหัสในหลอดทดลองหลังจากปฏิกิริยาของเอนไซม์ ตรวจพบฟอสโฟ-PKR โดยใช้ WBผลลัพธ์ของเราระบุว่า PKR phosphorylation ถูกยับยั้งโดย DARS-AS1 อย่างมีนัยสำคัญ แต่ไม่ใช่โดยการควบคุม RNA (รูปที่ 4f)ผลลัพธ์ ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า DARS-AS1 ยับยั้งการกระตุ้น PKR ที่ใช้ PACT เป็นสื่อกลางในเวลาเดียวกัน เรายังสังเกตเห็นการฟื้นตัวของ PACT ที่ลดลงเมื่อมี DARS-AS1 (รูปที่ 4f)ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับผลลัพธ์ของการสอบวิเคราะห์การจับโปรตีนในหลอดทดลอง (รูปที่ 4c) และแสดงให้เห็นอีกครั้งถึงฟังก์ชันการขัดขวางของ DARS-AS1 สำหรับการเชื่อมโยง PACT-PKR
Ser246 และ Ser287 ในโดเมน D3 ของ PACT จำเป็นสำหรับการเปิดใช้งาน PKR ภายใต้ความเครียดของเซลล์การแทนที่ของซีรีนเรซิดิวสองตัวสำหรับอะลานีนทำให้ PACT กลายพันธุ์ (mutD) ซึ่งกระตุ้น PKR ในกรณีที่ไม่มีความเครียด และการแทนที่สำหรับอะลานีน (mutA) กลับโปรโตคอลเนื่องจากเราได้แสดงให้เห็นความสำคัญของโดเมนนี้ในการเชื่อมโยงโดยตรงกับ DARS-AS1 เราจึงสร้างการกลายพันธุ์ของ PACT ทั้งสองนี้เพื่อทดสอบว่าสารตกค้างเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์กับ DARS-AS1 หรือไม่สิ่งที่น่าสนใจก็คือ การกลายพันธุ์ทั้งสองสูญเสียความสามารถในการจับกับ DARS-AS1 (รูปที่ 4d เสริม) ซึ่งบ่งชี้ว่าอาจจำเป็นต้องมีโครงสร้างที่สมบูรณ์ของโปรตีน PACT เพื่อให้ปฏิสัมพันธ์กับ DARS-AS1 มีประสิทธิภาพ
นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของเรายังแนะนำว่าการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่เกิดจาก DARS-AS1-shRNA สามารถฟื้นฟูได้บางส่วนโดยการแสดงการกลายพันธุ์เชิงลบที่โดดเด่นของ PACT (PACTmutA) หรือการกลายพันธุ์ PKR เชิงลบที่โดดเด่น (PKRmut) (รูปที่ 4e เพิ่มเติม)การแสดงออกที่มากเกินไปของการกลายพันธุ์ PKR ที่โดดเด่นและเชิงลบทำให้ PKR ฟอสโฟรีเลชั่นที่เหนี่ยวนำโดยการทำให้ล้มลงของ DARS-AS1 เช่นเดียวกับeIF2α phosphorylation ในเซลล์ที่ขาดซีรั่ม (รูปที่ 4g)ที่สำคัญกว่านั้น สัดส่วนของเซลล์ apoptotic ที่เหนี่ยวนำโดยการทำให้ล้มลงของ DARS-AS1 ก็ลดลงเช่นกันในเซลล์ที่แสดงออก PKRmut มากเกินไป (รูปที่ 4h และรูปที่ 4g เพิ่มเติม)การยับยั้งการทำงานของ PKR kinase ยังบั่นทอนการทำงานของ DARS-AS1 เนื่องจากผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการล้มลงของ DARS-AS1 นั้นไม่ค่อยกระตุ้น PKR และ eIF2α phosphorylation เมื่อเซลล์ได้รับการรักษาด้วยตัวยับยั้ง C16 จำเพาะ PKR (รูปที่ 4i และรูปที่ 4 เพิ่มเติม)).เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า DARS-AS1 ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์ อย่างน้อยก็บางส่วนโดยการยับยั้งการกระตุ้น PKR ที่อาศัย PACT
เพื่อสำรวจบทบาทของ DARS-AS1 เพิ่มเติมในการเกิดเนื้องอก เราทำการทดลองในร่างกายโดยใช้แบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ของเมาส์ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการล้มลงของ DARS-AS1 ทำให้การเติบโตของเนื้องอกในหนูลดลงอย่างมาก (ค่า p < 0.0001) (รูปที่ 5a) ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการล้มลงของ DARS-AS1 ทำให้การเติบโตของเนื้องอกในหนูลดลงอย่างมาก (ค่า p < 0.0001) (รูปที่ 5a) Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการล้มลงของ DARS-AS1 ช่วยลดการเติบโตของเนื้องอกในหนูได้อย่างมาก (ค่า p < 0.0001) (รูปที่ 5a)结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（ภาพที่5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（ภาพที่5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (ริยา) ผลการศึกษาพบว่าการล้มลงของ DARS-AS1 ช่วยลดการเติบโตของเนื้องอกในหนูทดลองอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า p <0.0001) (รูปที่ 5a)ดังนั้น ในกลุ่มการทำให้ล้มลง DARS-AS1 มีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในปริมาตรเนื้องอกเฉลี่ยประมาณ 72.9% และมวลเนื้องอกเฉลี่ยประมาณ 87.8% (รูปที่ 5b-d)ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำอย่างยิ่งว่า DARS-AS1 สามารถส่งเสริมการเติบโตของเนื้องอกในร่างกายได้อย่างมีนัยสำคัญ
ผลของโฆษณา DARS-AS1 ล้มลงต่อมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักในหนูเปลือยกราฟแสดงการเจริญเติบโต (a), ขนาดเนื้องอก (b), น้ำหนัก (c) และภาพเนื้องอก (d)แถบข้อผิดพลาดแสดงถึง±SEM n = 10 ****p < 0.0001 โดยการทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน n = 10 ****p < 0.0001 โดยการทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10 ****p < 0.0001 การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้านน = 10. ****p < 0.0001，ไม่ 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 การทดสอบแบบสองทางของนักเรียนe Kaplan-Meier วิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างระดับการแสดงออกของ DARS-AS1 กับการรอดชีวิตโดยรวมในผู้ป่วยที่มี UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM และ LGGระดับสูงของการแสดงออกของ DARS-AS1 ในผู้ป่วยอยู่ในกลุ่ม 50% แรก;ระดับการแสดงออกของ DARS-AS1 ต่ำในผู้ป่วยอยู่ที่ 50% ต่ำสุดค่า p ถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบอันดับบันทึกf โมเดลที่เสนอซึ่ง DARS-AS1 ควบคุมเส้นทาง PACT-PKR และการเติบโตของเนื้องอก
เพื่อให้เข้าใจผลกระทบทางคลินิกของ DARS-AS1 ได้ดีขึ้น เราได้ตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกและการอยู่รอดของผู้ป่วยจากการวิเคราะห์ชุดข้อมูล TCGA เราพบว่าการแสดงออกของ DARS-AS1 ที่สูงขึ้นนั้นสัมพันธ์กับ uveal melanoma (UVM), renal chromophobia (KICH), renal papillary cell carcinoma (KIRP), Mesothelioma (MESO), multiplexการรอดชีวิตที่ต่ำกว่ามีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับ glioblastoma morphosis (GBM) และผู้ป่วยที่มี glioma ในสมองระดับต่ำ (LGG) (รูปที่ 5e)ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า DARS-AS1 อาจมีบทบาทสำคัญในการลุกลามของเนื้องอกทางคลินิก และอาจเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่คาดการณ์ได้ในมะเร็งหลายชนิด
ในการศึกษานี้ โดยใช้การคัดกรองเชิงฟังก์ชัน CRISPRi ขนาดใหญ่ เราได้พิจารณาแล้วว่า DARS-AS1 lncRNA เอาชนะความเครียดของเซลล์มะเร็งด้วยการควบคุมตัวตอบสนองต่อความเครียดที่สำคัญสองอย่าง PACT และ PKRโดยการโต้ตอบโดยตรงกับ PACT DARS-AS1 ยับยั้งการกระตุ้น PKR ที่ใช้ PACT ซึ่งเป็นสื่อกลาง ดังนั้นจึงป้องกันการตายของเซลล์ apoptotic และส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์ (รูปที่ 5f)มีการสังเกตการเพิ่มขึ้นของ DARS-AS1 ในมะเร็งหลายชนิด ซึ่งบ่งชี้ว่าการทำงานของมันในการส่งเสริมการอยู่รอดของเซลล์มะเร็งภายใต้สภาวะที่ตึงเครียดอาจนำไปใช้กับมะเร็งหลายประเภทในวงกว้าง
PACT ได้รับการระบุว่าเป็นโปรตีนกระตุ้น PKR และการกระตุ้น PKR แบบอาศัย PACT มีบทบาทสำคัญในการตอบสนองต่อความเครียดโดยควบคุมการถอดรหัส การแปล การตายของเซลล์ และกระบวนการของเซลล์ที่สำคัญอื่นๆ62เป็นเวลาหลายทศวรรษมาแล้วที่พยายามทำความเข้าใจกฎระเบียบเฉพาะของมะเร็งของน้ำตก PACT-PKRในที่นี้ การศึกษาของเราเผยให้เห็นกลไกที่แตกต่างกันของการควบคุม PACT-PKR ในเซลล์มะเร็งผ่าน lncRNA ของเซลล์ DARS-AS1 ซึ่งจับกับ PACT โดยตรง บล็อกการโต้ตอบของ PACT-PKR ยับยั้งการกระตุ้น PKR และ eIF2α phosphorylation ซึ่งจะยับยั้งการตายของเซลล์ที่เกิดจากความเครียด และ กระตุ้นการแพร่กระจายของมะเร็งในที่สุดเซลล์.การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นถึงเป้าหมายของ lncRNA ที่เป็นไปได้สำหรับการพยากรณ์โรคมะเร็งและการรักษา
ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าการล้มลงของ DARS-AS1 ทำให้เซลล์ไวต่อความอดอยากในซีรัมด้วยการเพิ่มขึ้นของ PKR และ eIF2α ที่มีฟอสโฟรีเลตอย่างมีนัยสำคัญผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า DARS-AS1 ส่งเสริมการอยู่รอดของเซลล์มะเร็งภายใต้สภาวะที่ไม่เอื้ออำนวยโดยการยับยั้งการทำงานของ PACT/PKRRNA ที่ไม่เข้ารหัสอื่น ๆ อีกหลายตัว เช่น ASPACT และ nc886 ยังเกี่ยวข้องกับแกน PACT/PKR โดยการปรับลด PACT48 mRNA หรือควบคุม autophosphorylation โดยการจับกับ PKR49,50,64ในหมู่พวกเขา DARS-AS1 ทำหน้าที่เป็นผู้ทำลายสมาคม PACT-PKRการศึกษานี้เสริมสร้างความเข้าใจของเราเกี่ยวกับการควบคุมแกน PACT/PKR และบทบาทของ lncRNAs ในการตอบสนองต่อความเครียด
PACT มีโดเมนแยกกันสามโดเมนdsRBD สองตัวแรกแต่ละอันเพียงพอที่จะบรรลุผลการจับที่มีสัมพรรคภาพสูงของ PACT กับ PKR ในขณะที่โดเมนที่สาม (D3) จำเป็นสำหรับการเปิดใช้งาน PKR ในหลอดทดลอง และ ในร่างกายการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า DARS-AS1 มีปฏิสัมพันธ์กับโดเมน D3 โดยเฉพาะ (รูปที่ 3h)ด้วยขนาดที่ใหญ่ของ lncRNA (768 นิวคลีโอไทด์) การจับ DARS-AS1 กับ D3 สามารถยับยั้งการทำงานร่วมกันทางกายภาพระหว่างโดเมน PACT ของ dsRBD และ PKR ดังนั้นจึงขัดขวางการเชื่อมโยงของ PACT และ PKRการกลายพันธุ์ของจุด PACT ที่แทนที่ Ser246 และ Ser287 ใน D3 ด้วยอะลานีนหรือแอสพาเทตขัดขวางความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันกับ DARS-AS1 ซึ่งชี้ให้เห็นถึงความสำคัญของคุณสมบัติทางโครงสร้างและทางไฟฟ้าโดยรวมของ D3 ในการเชื่อมโยงรายละเอียดเพิ่มเติมของกลไกนี้จะต้องใช้ในอนาคต โดยใช้การวิเคราะห์ทางชีวเคมีที่แม่นยำยิ่งขึ้นและการวิเคราะห์โครงสร้าง PACT ที่มีความละเอียดสูง
การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานว่า DARS-AS1 ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์ผ่านกลไกต่างๆ51,52,53ในตัวอย่างหนึ่ง ผู้วิจัยตั้งข้อสังเกตว่า DARS-AS1 ได้ควบคุมยีน DARS ที่เข้ารหัสโปรตีน antisense โดยการกำหนดเป้าหมาย miP-194-5p ในเซลล์มะเร็งไตอย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้ การล้มลงของ DARS-AS1 มีผลเพียงเล็กน้อยต่อการถอดรหัส DARS ในมะเร็งหลายประเภท รวมถึงมะเร็งลำไส้ใหญ่ มะเร็งเต้านม และตับเป็นอย่างน้อยเนื่องจาก lncRNAs แสดงรูปแบบการแสดงออกที่จำเพาะต่อเซลล์และเนื้อเยื่อ กลไกการทำงานจึงอาจไม่อนุรักษ์ไว้ข้ามประเภทของมะเร็ง ซึ่งอาจมีส่วนทำให้เกิดความคลาดเคลื่อนระหว่างการสังเกตของเรากับการประเมินมะเร็งชนิดต่างๆ ก่อนหน้านี้จำเป็นต้องมีการศึกษาพิเศษเพื่ออธิบายกลไกเฉพาะของกระบวนการทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยาต่างๆ
การวิเคราะห์ข้อมูลทางคลินิกแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ DARS-AS1 ในเนื้องอกมีความสัมพันธ์แบบผกผันกับการอยู่รอดของผู้ป่วยโรคมะเร็ง ซึ่งเน้นย้ำถึงความสำคัญของแกน DARS-AS1/PACT/PKR ในการพยากรณ์โรคมะเร็งโดยสรุป การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า DARS-AS1 เป็นสารควบคุมของแกนส่งสัญญาณ PACT/PKR ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็ง และยับยั้งการตายของเซลล์มะเร็งในระหว่างการตอบสนองต่อความเครียด ซึ่งเป็นงานวิจัยอีกแนวหนึ่งและเป็นที่สนใจสำหรับการวิจัยในอนาคตเกี่ยวกับการรักษาที่เป็นไปได้ .
สายเซลล์ของมนุษย์ SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 และ HEK293T ได้มาจากโครงสร้างพื้นฐานทรัพยากรสายเซลล์แห่งชาติในประเทศจีนเซลล์ทั้งหมดได้รับการบำรุงรักษาในตัวกลาง DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ที่เสริมด้วย FBS 10% (Gemini, Brooklyn, NY) และ 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ที่ 37°C, 5% CO2ตู้ฟัก.
ต่อต้าน PACT, Abcam (ab31967);ต่อต้าน PKR, Abcam (ab184257);สารต้าน PKR (ฟอสโฟ-T451), Abcam (ab81303);ต่อต้านธง, Abcam (ab125243);แอนติ-eIF2α, Abcam (A0764));ต้าน eIF2α (ฟอสฟอรัส S51), Abcam (ab32157);ต่อต้าน PACT (ฟอสฟอรัส S246), Abgent (AP7744b);ต่อต้านβ-tubulin, CST (2128);IgG ของเมาส์ปกติ, CST (5415S);IgG กระต่ายปกติ, CST (2729S)แอนติบอดีถูกเจือจาง 1:1000 ใน PBST สำหรับ Western blotting และ 1:100 สำหรับ IP
sgRNAs ได้รับการพัฒนาโดยใช้เครื่องมือที่เปิดเผยต่อสาธารณะที่เรียกว่า CRISPR-ERA66เราใช้พารามิเตอร์เครื่องมือเริ่มต้นสำหรับการพัฒนา sgRNA และอัลกอริทึมที่คำนวณไซต์การผูก sgRNA ในพื้นที่ 3 kbมีศูนย์กลางอยู่ที่ TSSแหล่งรวมของ sgRNA โอลิโกนิวคลีโอไทด์ถูกสังเคราะห์ที่ CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) และโคลนไปเป็น pgRNA พลาสมิดที่ทำให้มีลักษณะของมนุษย์ (Addgene #44248)รวม 12 ไมโครกรัมของ pgRNA พลาสมิดที่ทำให้มีลักษณะของมนุษย์ที่รวมกลุ่ม, 7.2 ไมโครกรัมของ psPAX2 (Addgene #12260) และ 4.8 ไมโครกรัมของ pMD2.G (Addgene #12259) ถูกทรานส์เฟกร่วมกันใน 5 x 106 HEK293T ในจานขนาด 10 ซม. โดยใช้ DNAfect Transfection Reagent เซลล์ (CWBIO, ปักกิ่ง, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตส่วนลอยเหนือตะกอนที่ประกอบด้วยไวรัสถูกรวบรวม 48 และ 72 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชันและกรองผ่านตัวกรอง 0.45 ไมโครเมตรสำหรับการคัดกรอง เซลล์ SW620 ซึ่งแสดงออกโปรตีนหลอมรวม dCas9/KRAB ได้มาจากการถ่ายทอดไวรัสเซลล์ SW620 ที่ถูกดัดแปลงติดไวรัสในคลังไวรัสในการทดลองการติดเชื้ออิสระสี่การทดลองที่ MOI ที่ 0.1-0.3 และสุ่มตัวอย่างด้วยพูโรมัยซิน 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (Sigma, St. Louis, MO) เป็นเวลา 2 วันหลังจากนั้น เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 18 วัน ในหลอดทดลอง โดยมีความครอบคลุมห้องสมุดขั้นต่ำที่ 500 เซลล์/sgRNA สำหรับการตรวจคัดกรอง
จีโนม DNA ถูกสกัดตามคำแนะนำของ QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183)โดยรวมแล้ว ใช้จีโนม DNA 100 ไมโครกรัมต่อการทำซ้ำทางชีวภาพเพื่อสร้างห้องสมุดขอบเขต sgRNA ถูกขยายโดย PCR สองรอบและเชื่อมโยงกับบาร์โค้ด
ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เจล NucleoSpin® และชุดทำบริสุทธิ์ด้วย PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, เยอรมนี; 740609.250) และหาปริมาณโดยใช้ชุดตรวจหา DNA แบบเกลียวคู่ Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854)
การทดสอบ MTS ใช้เพื่อวัดการเพิ่มจำนวนเซลล์เซลล์ถูกเพาะในเพลต 96 หลุมที่ความหนาแน่นเริ่มต้นที่ 2,000 เซลล์/หลุมจำนวนเซลล์สัมพัทธ์ถูกวัดทุกวัน ณ เวลาที่ระบุรวมเป็น 4-6 วันสำหรับแต่ละหลุม รีเอเจนต์ MTS (Promega) 20 ไมโครลิตรถูกเจือจางด้วย DMEM 100 ไมโครลิตร บ่มด้วยเซลล์เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37°C จากนั้นจึงวัด OD490
ความสามารถในการเติบโตแบบไม่ยึดเกาะถูกค้นพบโดยการวิเคราะห์การก่อตัวของทรงกลมโดยสังเขป 2,000 เซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วย shRNA DARS-AS1 หรือ shRNA ควบคุมถูกเพาะเลี้ยงในไมโครเพลทการยึดเกาะต่ำมาก (คอร์นิง) โดยมีการเปลี่ยนแปลงปานกลางทุก 4 วันสเฟียรอยด์ถูกนับหลังจาก 14 วัน500 เซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วย DARS-AS1 overexpression plasmid หรือ control plasmid ถูกใช้สำหรับการทดสอบการเพิ่มประสิทธิภาพ มิฉะนั้น วิธีการนี้จะไม่เปลี่ยนแปลง
RNA ถูกคัดลอกโดยใช้ T7 RNA polymerase และ biotin-16-UTP (Roche 1138908910) ตามคำแนะนำของ Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440)ไพรเมอร์ที่ใช้ในที่นี้แสดงอยู่ในตารางเสริม 4
บริเวณ PACT หรือ PKR ซึ่งกำหนดรหัสโปรตีนถูกโคลนไปเป็น pET15b (แอดยีน #73619) และถูกทรานส์ฟอร์มเป็น BL21(DE3)แบคทีเรียถูกบ่มข้ามคืนใน LB ที่ให้มากับแอมพิซิลลินและจากนั้นเจือจาง 100 เท่าด้วย LB สดเมื่อ OD600 ของตัวกลางถึง 0.8, IPTG 1 มิลลิโมลาร์ถูกเติมเพื่อกระตุ้นการแสดงออกของโปรตีนหลังจากการฟักไข่ข้ามคืนด้วยการเขย่าเบาๆ (250 รอบต่อนาที ที่ 20°C) เม็ดเซลล์ถูกรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยง (4000 รอบต่อนาที, 10 นาที, 4°ซ)แขวนตะกอนเซลล์ใหม่ในบัฟเฟอร์การสลาย (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) และฟักไข่บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นโซนิเคต (15 นาที เปิด/ปิด 5 วินาที บนน้ำแข็ง) และปั่นแยก (13,000) รอบต่อนาที), 30 นาที, 4°ซ).จากนั้นนำ supernatant ไปวางบน Ni-NTA resin (QIAGEN) 3 ครั้งที่ 4°C, ล้าง 4 ครั้งด้วย wash buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM อิมิดาโซล, 250 mM NaCl) และชะ 3 ครั้ง, รวมทั้งหมด ของบัฟเฟอร์ตัวชะ 10 มล. (ทริส 50 มิลลิโมลาร์, pH 8.0, NaCl 250 มิลลิโมลาร์, อิมิดาโซล 300 มิลลิโมลาร์)โปรตีนบริสุทธิ์ถูกกำหนดหาโดยใช้ WB และความเข้มข้นถูกกำหนดหาโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212)
การทดสอบ RIP ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยมีการปรับเปลี่ยนโดยสังเขป 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 ค็อกเทล (Roche, 1 mM DTT) และปั่นแยกที่ 13,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที ที่ 4 °Cจากนั้น ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกบ่มด้วยโปรตีนเม็ดบีดแม่เหล็ก A+G (มิลลิพอร์) ที่คอนจูเกตด้วยแอนติบอดีต้าน PACT (Abeam) หรือ IgG (CST) 5 ไมโครกรัมเม็ดบีดถูกล้าง 5 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์ RIP 5x จากนั้นจึงย่อยด้วยโปรตีเอส K (NEB)สกัด RNA ด้วยไตรซอลและกำหนดหาโดย RT-qPCRไพรเมอร์ถูกนำเสนอในตารางเสริม 5
การทดสอบ RIP ในหลอดทดลองดำเนินการตามโปรโตคอลการทดสอบ RIP มาตรฐานที่แก้ไขแล้วรวม 5 pmol ของ RNA ที่ถอดเสียงในหลอดทดลองถูกเจือจาง 1x ด้วยบัฟเฟอร์ RIP และอบอ่อนโดยการฟักไข่ที่ 65 °C เป็นเวลา 5 นาทีตามด้วยการเย็นตัวช้าจนถึงอุณหภูมิห้องโปรตีน PACT ที่ติดฉลากธงที่ไม่เสียหายหรือกลายพันธุ์ทั้งหมด 5 pmol ถูกทำให้บริสุทธิ์จาก E. coliฟักไข่ด้วย RNA ที่ปรับสภาพใหม่เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C และปฏิบัติตามขั้นตอนข้างต้นสำหรับการวิเคราะห์ RIP สำหรับ IP ที่ป้องกันแฟล็ก
สำหรับการวิเคราะห์ส่วนขยาย RNA 1×107 เซลล์ถูกสลายด้วยบัฟเฟอร์ 1xRIPหลังจากการปั่นแยกที่ 13,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4°C เหนือตะกอนจะถูกปรับสภาพด้วยลูกปัดแม่เหล็กสเตรปทาวิดิน 30 ไมโครลิตร (เบ็คแมน) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 4°ซจากนั้น ไลเซทที่บริสุทธิ์แล้วจะถูกจัดหาด้วย tRNA ของยีสต์และบ่มด้วย 40 pmol ของ RNA ที่ปรับสภาพใหม่ค้างคืนที่ 4°C จากนั้นอีก 2 ชั่วโมงและ 20 ไมโครลิตรของลูกปัดแม่เหล็กสเตรปทาวิดินใหม่ที่ถูกบล็อกด้วย BSAขั้นตอนการล้างประกอบด้วย 4 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์ RIP 5 เท่า และ 4 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์ RIP 1 ครั้งโปรตีนที่สอดคล้องกันถูกชะด้วยบัฟเฟอร์สำหรับชะล้างด้วยไบโอติน (ทริส-HCl 25 มิลลิโมลาร์, pH 7.5, 12.5 มิลลิโมลาร์ D-ไบโอติน, PMSF) และแยกบน NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen)หลังจากการย้อมสีเงิน (Beyotime Biotechnology) แถบบางวงถูกตัดออกและวิเคราะห์โดย MS
วิเคราะห์ Co-IP เพื่อทดสอบการทำงานร่วมกันระหว่าง PACT และ PKRโดยสังเขป ไลเซตเหนือตะกอนถูกเตรียมโดยการฟักไข่ 1 x 107 เซลล์ที่ถูกสลายใน 1 x RIP buffer ที่ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4°ซไลเซตถูกบรรจุด้วยเม็ดแม่เหล็กโปรตีน A + G คอนจูเกตด้วยแอนติ-PACT แอนติบอดี 5 ไมโครกรัม และหมุนเบาๆ ข้ามคืนที่ 4°Cลูกปัดถูกล้าง 3 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์ 5×RIP, สองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ 1×RIP และชะด้วยบัฟเฟอร์ 1×SDSโปรตีนที่กู้คืนถูกวิเคราะห์โดยเจล SDS-PAGE และตรวจพบโดย WB
สอง pmol ของ PACT ที่ถูกตั้งค่าสถานะและ 1 pmol ของ PKR ถูกทำให้บริสุทธิ์จาก E. coliเจือจางในบัฟเฟอร์ RIP 1× และฟักด้วย 10 pmol ของ RNA ที่ปรับสภาพใหม่เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 4 °Cหลังจากนั้น พวกมันถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต้านฉลากโปรตีน A+G ที่คอนจูเกตด้วยลูกปัดแม่เหล็กเป็นเวลาอีกสองชั่วโมงจากนั้น ลูกปัดถูกล้างสี่ครั้งด้วยบัฟเฟอร์ RIP 1x และชะด้วยบัฟเฟอร์ SDS 1xPACT และ PKR ที่เป็นผลลัพธ์ถูกตรวจพบโดย WB