ข่าว

ขอบคุณสำหรับการเยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันของเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้ได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงผลไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
วิธีการติดฉลากความใกล้ชิดของเอนไซม์ตามเอสเทอร์ที่กระตุ้นหรืออนุมูลจากฟีน็อกซีนั้นใช้กันอย่างแพร่หลายในการทำแผนที่โปรตีโอมย่อยเซลล์และตัวโต้ตอบโปรตีนในเซลล์ที่มีชีวิตอย่างไรก็ตาม เอสเทอร์ที่กระตุ้นปฏิกิริยามีปฏิกิริยาน้อยกว่า ส่งผลให้มีรัศมีการติดฉลากกว้าง และฟีน็อกซีเรดิคัลที่เกิดจากการบำบัดเปอร์ออกไซด์สามารถรบกวนวิถีรีดอกซ์ได้ในที่นี้ เรารายงานวิธีการกระตุ้นด้วยแสงโดยอาศัยการติดฉลากบริเวณใกล้เคียง (PDPL) ที่พัฒนาขึ้นโดยการเชื่อมโยงทางพันธุกรรมของโปรตีนที่ไวต่อแสง miniSOG กับโปรตีนที่น่าสนใจกระตุ้นโดยแสงสีน้ำเงินและควบคุมโดยเวลาในการเปิดรับแสง ออกซิเจนเดี่ยวจะถูกสร้างขึ้น จากนั้นจึงทำการติดฉลากสารตกค้างของฮิสทิดีนที่ตกค้างอยู่ในบริเวณเดียวกันโดยโพรบ anilineเราแสดงให้เห็นถึงความเที่ยงตรงสูงผ่านการทำแผนที่โปรตีนจำเพาะของออร์แกเนลล์การเปรียบเทียบ PDPL กับ TurboID แบบเคียงข้างกัน แสดงให้เห็นถึงความครอบคลุมของโปรตีน PDPL ที่เฉพาะเจาะจงและครอบคลุมมากขึ้นต่อไป เราใช้ PDPL กับตัวกระตุ้นการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับโรค BRD4 และ E3 Parkin ligase และพบตัวโต้ตอบที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้โดยการตรวจคัดกรองการแสดงออกมากเกินไป ระบุซับสเตรตที่ไม่รู้จักสองชนิด Ssu72 และ SNW1 สำหรับพาร์กิน ซึ่งการย่อยสลายถูกสื่อกลางโดยวิถีการแพร่หลาย-โปรตีโอโซม
การกำหนดลักษณะเฉพาะที่แม่นยำของเครือข่ายโปรตีนรองรับกระบวนการพื้นฐานของเซลล์จำนวนมากดังนั้น การทำแผนที่ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีน spatiotemporal ที่แม่นยำสูงจะให้พื้นฐานระดับโมเลกุลสำหรับการถอดรหัสวิถีทางชีวภาพ พยาธิวิทยาของโรค และขัดขวางการโต้ตอบเหล่านี้เพื่อวัตถุประสงค์ในการรักษาด้วยเหตุนี้ วิธีการที่สามารถตรวจจับปฏิสัมพันธ์ชั่วคราวในเซลล์หรือเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิตจึงเป็นที่ต้องการอย่างมากในอดีตมีการใช้ Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) เพื่อระบุพันธมิตรที่มีผลผูกพันของโปรตีนที่น่าสนใจ (POI)ด้วยการพัฒนาวิธีการโปรตีโอมิกเชิงปริมาณ Bioplex3.0 ถูกสร้างขึ้น ซึ่งเป็นฐานข้อมูลที่ใหญ่ที่สุดของเครือข่ายโปรตีนที่ใช้ AP-MSแม้ว่า AP-MS จะมีประสิทธิภาพมาก แต่ขั้นตอนการสลายเซลล์และการเจือจางในเวิร์กโฟลว์มีความเอนเอียงต่อการโต้ตอบที่มีผลผูกพันที่อ่อนแอและชั่วคราว และแนะนำสิ่งประดิษฐ์หลังการสลาย เช่น คู่ปฏิสัมพันธ์ปลอมที่ไม่มีการแบ่งส่วนก่อนการแยกส่วน
เพื่อแก้ไขปัญหาเหล่านี้ ได้มีการพัฒนากรดอะมิโนที่ผิดธรรมชาติ (UAA) ที่มีกลุ่มเชื่อมขวางและแพลตฟอร์มการติดฉลากใกล้เคียงด้วยเอนไซม์ (PL) (เช่น APEX และ BioID)5แม้ว่าวิธีการ UAA จะถูกนำมาใช้อย่างประสบความสำเร็จในหลาย ๆ สถานการณ์และให้ข้อมูลเกี่ยวกับการยึดเกาะโปรตีนโดยตรง แต่การเพิ่มประสิทธิภาพของไซต์การแทรก UAA ก็ยังจำเป็นที่สำคัญกว่านั้นคือวิธีการติดฉลากปริมาณสารสัมพันธ์ที่ไม่มีการพลิกกลับตัวเร่งปฏิกิริยาของเหตุการณ์การติดฉลากในทางตรงกันข้าม วิธี PL ที่ใช้เอนไซม์ เช่น วิธี BioID จะหลอมรวม biotin ligase ที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมกับ POI7 ซึ่งจะกระตุ้นไบโอตินในภายหลังเพื่อสร้าง biotinyl-AMP ester ระดับกลางที่ทำปฏิกิริยาเอนไซม์จึงกระตุ้นและปล่อย "ก้อนเมฆ" ของไบโอตินที่กระตุ้นการทำงานซึ่งติดฉลากสารตกค้างไลซีนใกล้เคียงอย่างไรก็ตาม BioID ต้องใช้เวลามากกว่า 12 ชั่วโมงเพื่อให้ได้สัญญาณที่ติดฉลากเพียงพอ ซึ่งทำให้ไม่สามารถใช้ BioID กับความละเอียดชั่วขณะได้ด้วยการใช้วิวัฒนาการโดยตรงตามการแสดงผลของยีสต์ TurboID ได้รับการออกแบบตาม BioID ให้มีประสิทธิภาพมากขึ้น ทำให้สามารถติดฉลากไบโอตินได้อย่างมีประสิทธิภาพภายใน 10 นาที ทำให้สามารถศึกษากระบวนการไดนามิกได้มากขึ้นเนื่องจาก TurboID มีฤทธิ์สูง และระดับไบโอตินภายในร่างกายก็เพียงพอสำหรับการติดฉลากระดับต่ำ การติดฉลากพื้นหลังจะกลายเป็นปัญหาที่อาจเกิดขึ้นได้เมื่อจำเป็นต้องมีการติดฉลากขั้นสูงและกำหนดเวลาโดยการเพิ่มไบโอตินจากภายนอกนอกจากนี้ เอสเทอร์ที่กระตุ้นปฏิกิริยายังทำปฏิกิริยาได้ไม่ดี (t1/2 ~ 5 นาที) ซึ่งสามารถนำไปสู่รัศมีการติดฉลากขนาดใหญ่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังจากอิ่มตัวของโปรตีนใกล้เคียงด้วยไบโอติน 5 ในอีกแนวทางหนึ่ง การหลอมรวมทางพันธุกรรมของแอสคอร์เบตเปอร์ออกซิเดสที่ถูกทำวิศวกรรม (เช่น ไบโอติน- ฟีนอลเรดิคอลและช่วยให้สามารถติดฉลากโปรตีนได้ภายในหนึ่งนาที9,10 APEX ใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อระบุโปรตีโอมย่อยเซลล์ โปรตีนเชิงซ้อนของโปรตีนเมมเบรน และคอมเพล็กซ์โปรตีนส่งสัญญาณไซโตซอล11,12 อย่างไรก็ตาม ความต้องการความเข้มข้นสูงของเปอร์ออกไซด์อาจส่งผลต่อโปรตีนรีดอกซ์หรือวิถีทางที่รบกวน กระบวนการเซลล์
ดังนั้นวิธีการใหม่ที่สามารถสร้างสปีชีส์ปราบปรามที่มีป้ายกำกับรัศมีที่มีปฏิกิริยามากขึ้นด้วยความแม่นยำเชิงพื้นที่และเวลาสูงโดยไม่รบกวนวิถีของเซลล์อย่างมีนัยสำคัญจะเป็นส่วนเสริมที่สำคัญสำหรับวิธีการที่มีอยู่ ในบรรดาสปีชีส์ที่เกิดปฏิกิริยา ออกซิเจนเดี่ยวกระตุ้นความสนใจของเราเนื่องจากอายุการใช้งานสั้นและรัศมีการแพร่กระจายที่จำกัด (t1/2 < 0.6 µs ในเซลล์)13 ในบรรดาสปีชีส์ที่เกิดปฏิกิริยา ออกซิเจนเดี่ยวกระตุ้นความสนใจของเราเนื่องจากอายุการใช้งานสั้นและรัศมีการแพร่กระจายที่จำกัด (t1/2 < 0.6 µs ในเซลล์)13 Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. ในบรรดารูปแบบที่ทำงานอยู่นั้น ออกซิเจนเดี่ยวดึงดูดความสนใจของเราเนื่องจากอายุการใช้งานสั้นและรัศมีการแพร่กระจายที่จำกัด (t1/2 < 0.6 µs ในเซลล์)13在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). ในรูปแบบแอคทีฟ ออกซิเจนเดี่ยวดึงดูดความสนใจของเราเนื่องจากมีอายุการใช้งานสั้นและมีรัศมีการแพร่กระจายที่จำกัด (t1/2 < 0.6 μs ในเซลล์)มีรายงานว่าออกซิเจนซิงเกิลt สุ่มออกซิไดซ์เมไทโอนีน ไทโรซีน ฮิสทิดีน และทริปโตเฟน ทำให้มีขั้ว 14,15 สำหรับการยึดติดกับโพรบที่มีเอมีนหรือไทออลเป็นพื้นฐาน 16,17แม้ว่าออกซิเจนเดี่ยวจะถูกนำมาใช้เพื่อติดฉลาก RNA ของช่องย่อยเซลล์ แต่กลยุทธ์ในการนำตัวทำเครื่องหมายความใกล้ชิด POI ภายนอกกลับมาใช้ใหม่ยังคงไม่ได้รับการสำรวจที่นี่ เราขอนำเสนอแพลตฟอร์มที่เรียกว่า photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL) ซึ่งเราใช้แสงสีน้ำเงินเพื่อส่องสว่าง POI ที่หลอมรวมกับโฟโตเซนซิไทเซอร์ miniSOG และกระตุ้นการสร้างออกซิเจนเดี่ยวเพื่อออกซิไดซ์สารตกค้างใกล้เคียง ตามด้วยการปรับเปลี่ยนที่ประกอบด้วยเอมีนเพื่อออกซิไดซ์โพรบเคมีลงใน เซลล์ที่มีชีวิตระดับกลาง.เราทดสอบกลุ่มของหัววัดทางเคมีเพื่อเพิ่มความจำเพาะของแท็กให้สูงสุดและระบุไซต์การดัดแปลงโดยใช้เวิร์กโฟลว์โปรตีโอมิกแบบเปิดการเปรียบเทียบ PDPL กับ TurboID แบบเคียงข้างกัน แสดงให้เห็นถึงความครอบคลุมของโปรตีน PDPL ที่เฉพาะเจาะจงและครอบคลุมมากขึ้นเราใช้วิธีการนี้กับเครื่องหมายจำเพาะของออร์แกเนลล์ของโปรตีโอมย่อยและการระบุโปรตีโอมทั่วไปของพันธมิตรที่มีผลผูกพันสำหรับโปรตีนควบคุมอีพีเจเนติกที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง BRD4 และ E3 ligase Parkin ที่เกี่ยวข้องกับโรคพาร์กินสัน ซึ่งยืนยันเครือข่ายโปรตีนทั้งที่รู้จักและไม่รู้จัก ปฏิสัมพันธ์.ความสามารถของ PDPL ในการจดจำซับสเตรต E3 ในคอมเพล็กซ์โปรตีนขนาดใหญ่แสดงถึงสถานการณ์ที่จำเป็นต้องมีการจดจำสารยึดเกาะทางอ้อมสารตั้งต้น parkin ที่ไม่รู้จักสองชนิดที่มีสื่อกลางโดย ubiquitination-proteasome ได้รับการยืนยันในแหล่งกำเนิด
การบำบัดด้วยโฟโตไดนามิก (PDT)19 และการหยุดทำงานด้วยเลเซอร์ช่วยด้วยโครโมฟอร์ (CALI)20 ซึ่งการฉายรังสีแสงด้วยสารไวแสงจะสร้างออกซิเจนเดี่ยว สามารถยับยั้งโปรตีนเป้าหมายหรือทำให้เซลล์ตายได้เนื่องจากออกซิเจนเดี่ยวเป็นสารที่มีปฏิกิริยาสูงโดยมีระยะการแพร่กระจายทางทฤษฎีประมาณ 70 นาโนเมตร จึงสามารถควบคุมการออกซิเดชันที่จำกัดเชิงพื้นที่รอบๆ ตัวตรวจจับแสงได้จากแนวคิดนี้ เราตัดสินใจใช้ออกซิเจนเดี่ยวเพื่อให้เกิดการติดฉลากโปรตีนเชิงซ้อนในเซลล์ที่มีชีวิตอย่างใกล้ชิดเราได้พัฒนาวิธีการทางเคมีของ PDPL เพื่อทำหน้าที่สี่ประการ: (1) เพื่อกระตุ้นการสร้างออกซิเจนเสื้อกล้ามแบบแอ็คทีฟที่คล้ายกับวิธีเอนไซม์ PL;(2) จัดให้มีการติดฉลากที่มีการแก้ไขเวลาเมื่อมีการเริ่มต้นแสง(3) โดยการเปลี่ยนแปลง (4) หลีกเลี่ยงการใช้ปัจจัยร่วมภายนอก (เช่นไบโอติน) เพื่อลดพื้นหลัง หรือใช้รีเอเจนต์ภายนอกที่ก่อกวนสูง (เช่นเปอร์ออกไซด์) เพื่อลดการสัมผัสเซลล์ต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม
สารไวแสงสามารถแบ่งออกเป็นสองประเภท ได้แก่ ฟลูออโรฟอร์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลขนาดเล็ก (เช่น เบงกอลกุหลาบ เมทิลีนบลู)22 และโปรตีนขนาดเล็กที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม (เช่น miniSOG, KillerRed)23เพื่อให้บรรลุการออกแบบโมดูลาร์ เราได้พัฒนาแพลตฟอร์ม PDPL รุ่นแรกโดยเพิ่มโปรตีนไวแสง (PS) ลงใน POI24,25 (รูปที่ 1a)เมื่อถูกฉายรังสีด้วยแสงสีน้ำเงิน ออกซิเจนเดี่ยวจะออกซิไดซ์สารตกค้างของกรดอะมิโนนิวคลีโอฟิลิกส่วนต้น ส่งผลให้เกิดขั้วอัมโพลังที่เป็นอิเล็กโตรฟิลลิก และสามารถทำปฏิกิริยากับโพรบโพรบนิวคลีโอไฟล์ได้16,17 เพิ่มเติมหัววัดได้รับการออกแบบด้วยที่จับที่เป็นอัลไคน์เพื่อให้เกิดปฏิกิริยาเคมีคลิกและดึงลงเพื่อดูลักษณะเฉพาะของ LC/MS/MS
ภาพประกอบแผนผังของการติดฉลากโปรตีนเชิงซ้อนที่อาศัย miniSOGเมื่อสัมผัสกับแสงสีน้ำเงิน เซลล์ที่แสดง miniSOG-POI จะสร้างออกซิเจนเดี่ยว ซึ่งจะปรับเปลี่ยนโปรตีนที่ทำปฏิกิริยา แต่ไม่ใช่โปรตีนที่ไม่จับผลิตภัณฑ์ขั้นกลางของโฟโตออกซิเดชันถูกดักจับโดยฉลากรีเลย์ของโพรบเคมีเอมีนเพื่อสร้างสารเสริมโควาเลนต์หมู่อัลไคนิลบนโพรบเคมียอมให้เคมีคลิกสำหรับการเสริมสมรรถนะโดยการดึงลงที่ตามด้วยการหาปริมาณ LC-MS/MSb โครงสร้างทางเคมีของโพรบเอมีน 1-4c การวิเคราะห์เจลเรืองแสงที่เป็นตัวแทนของไมโตคอนเดรียที่โลคัลไลซ์เซชันโปรตีโอมิกที่มีสื่อกลางแบบ miniSOG โดยใช้โพรบ 1-4 และการหาปริมาณสัมพัทธ์ตามการวัดความหนาแน่นของเจลอัตราส่วนสัญญาณต่อพื้นหลังของโพรบเคมีได้รับการประเมินโดยใช้การทดลองกลุ่มควบคุมเชิงลบ โดยไม่รวมแสงสีน้ำเงินหรือใช้เซลล์ HEK293T ที่ไม่มีการแสดงออกของ miniSOGn = 2 ตัวอย่างอิสระทางชีวภาพแต่ละจุดแสดงถึงแบบจำลองทางชีววิทยาd การตรวจจับตัวแทนและการหาปริมาณของ PDPL โดยใช้โพรบที่ปรับให้เหมาะสม 3 เมื่อมีหรือไม่มีส่วนประกอบ PDPL ที่ระบุ เช่น cn = 3 ตัวอย่างอิสระทางชีวภาพแต่ละจุดแสดงถึงแบบจำลองทางชีววิทยาเส้นกึ่งกลางและเส้นหนวดแสดงถึงค่าเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ±CBB: คูแมสซี่ บริลเลียนท์ บลูe การถ่ายภาพ Confocal ของออกซิเจนเสื้อกล้ามที่มีคราบ Si-DMA แดงแถบมาตราส่วน: 10 µmการถ่ายภาพเจลและการทดลองคอนโฟคอลถูกทำซ้ำอย่างอิสระอย่างน้อยสองครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน
ขั้นแรก เราทดสอบความสามารถของตัวรับแสงที่โตเต็มที่ miniSOG26 และ KillerRed23 ซึ่งแสดงออกอย่างเสถียรใน HEK293T เพื่อเป็นสื่อกลางในการติดฉลากโพรพาร์จิลามีนของโปรตีโอมเป็นโพรบเคมี (รูปที่ 1a เสริม)การวิเคราะห์เรืองแสงเจลแสดงให้เห็นว่าการติดฉลากโปรตีโอมทั้งหมดทำได้โดยใช้ miniSOG และการฉายรังสีแสงสีน้ำเงิน ในขณะที่ KillerRed ไม่พบผลิตภัณฑ์การติดฉลากที่มองเห็นได้เพื่อปรับปรุงอัตราส่วนสัญญาณต่อพื้นหลัง เราจึงทดสอบชุดโพรบเคมีที่มีอะนิลีน (1 และ 3) โพรพิลามีน (2) หรือเบนซิลเอมีน (4)เราสังเกตว่าเซลล์ HEK293T เองมีสัญญาณพื้นหลังที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการไม่มีแสงสีน้ำเงิน อาจเป็นเพราะตัวรับแสงจากไรโบฟลาวินจากภายนอก ฟลาวินโมโนนิวคลีโอไทด์ (FMN) 27 หัววัดเคมีแบบ Aniline 1 และ 3 ให้ความจำเพาะที่ดีกว่า โดย HEK293T แสดง miniSOG ในไมโตคอนเดรียอย่างเสถียรซึ่งแสดงสัญญาณเพิ่มขึ้น 8 เท่าสำหรับโพรบ 3 ในขณะที่โพรบ 2 ใช้ในวิธีการติดฉลากอาร์เอ็นเอ CAP-seq แสดงเฉพาะ ~2.5- การเพิ่มขึ้นของสัญญาณพับ อาจเนื่องมาจากความชอบในการเกิดปฏิกิริยาที่แตกต่างกันระหว่าง RNA และโปรตีน (รูปที่ 1b, c) หัววัดเคมีแบบ Aniline 1 และ 3 ให้ความจำเพาะที่ดีกว่า โดย HEK293T แสดง miniSOG ในไมโตคอนเดรียอย่างเสถียรซึ่งแสดงสัญญาณเพิ่มขึ้น 8 เท่าสำหรับโพรบ 3 ในขณะที่โพรบ 2 ใช้ในวิธีการติดฉลากอาร์เอ็นเอ CAP-seq แสดงเฉพาะ ~2.5- การเพิ่มขึ้นของสัญญาณพับ อาจเนื่องมาจากความชอบในการเกิดปฏิกิริยาที่แตกต่างกันระหว่าง RNA และโปรตีน (รูปที่ 1b, c)หัววัดเคมีแบบ Aniline 1 และ 3 แสดงความจำเพาะที่ดีกว่า: HEK293T ซึ่งแสดง miniSOG ในไมโตคอนเดรียได้อย่างเสถียร แสดงสัญญาณที่เพิ่มขึ้นมากกว่า 8 เท่าสำหรับโพรบ 3 ในขณะที่โพรบ 2 ใช้ในวิธีการติดฉลาก CAP-seq RNA เท่านั้น แสดงการเพิ่มขึ้นของสัญญาณ ~2.5 เท่า อาจเป็นเพราะความชอบในปฏิกิริยาที่แตกต่างกันระหว่าง RNA และโปรตีน (รูปที่ 1b, c)基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAหัววัดเคมีแบบ Aniline 1 และ 3 มีความจำเพาะที่ดีกว่า HEK293T แสดง miniSOG อย่างเสถียรในไมโตคอนเดรีย และโพรบ 3 มีสัญญาณเพิ่มขึ้นมากกว่า 8 เท่า ในขณะที่โพรบ 2 สำหรับวิธีการติดฉลาก RNA CAP-seq นั้นเพิ่มขึ้นเพียง 2.5 เท่าในสัญญาณ อาจเป็นเพราะความชอบในปฏิกิริยาที่แตกต่างกันระหว่าง RNA และโปรตีน (รูปที่ 1b, c)นอกจากนี้ โพรบ 3 ไอโซเมอร์และโพรบไฮดราซีน (โพรบ 5, 6, 7) ได้รับการทดสอบ ยืนยันการปรับให้เหมาะสมของโพรบ 3 (รูปที่ 1b,c เสริม)ในทำนองเดียวกัน การวิเคราะห์การเรืองแสงในเจลเผยให้เห็นพารามิเตอร์การทดลองที่ปรับให้เหมาะสมอื่นๆ: ความยาวคลื่นของการฉายรังสี (460 นาโนเมตร) ความเข้มข้นของโพรบเคมี (1 mM) และเวลาฉายรังสี (20 นาที) (รูปที่ 2a–c เพิ่มเติม)การละเว้นส่วนประกอบหรือขั้นตอนใดๆ ในโปรโตคอล PDPL ส่งผลให้สัญญาณย้อนกลับไปยังพื้นหลังอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1d)โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การติดฉลากโปรตีนลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อมีโซเดียมเอไซด์หรือโทรลอกซ์ ซึ่งทราบกันดีว่าดับออกซิเจนเสื้อกล้ามการมีอยู่ของ D2O ซึ่งทราบกันดีอยู่แล้วว่าช่วยให้ออกซิเจนเสื้อกล้ามมีความเสถียร ช่วยเพิ่มสัญญาณการติดฉลากเพื่อตรวจสอบการมีส่วนร่วมของออกซิเจนปฏิกิริยาชนิดอื่นๆ ในการติดฉลาก แมนนิทอลและวิตามินซีถูกเติมเพื่อสร้างสารกำจัดอนุมูลอิสระไฮดรอกซิลและซูเปอร์ออกไซด์ตามลำดับ 18, 29 แต่ไม่พบการติดฉลากเพื่อลดการติดฉลากการเติม H2O2 แต่ไม่ให้แสงสว่าง ไม่ทำให้เกิดการติดฉลาก (รูปที่ 3a เพิ่มเติม)การถ่ายภาพออกซิเจนสายเดี่ยวเรืองแสงด้วยหัววัด Si-DMA ยืนยันว่ามีออกซิเจนสายเดี่ยวในสาย HEK293T-miniSOG แต่ไม่ได้อยู่ในสาย HEK293T ดั้งเดิมนอกจากนี้ mitoSOX Red ยังตรวจไม่พบการผลิตซูเปอร์ออกไซด์หลังจากให้แสงสว่าง (รูปที่ 1e และรูปที่ 3b เพิ่มเติม) 30 ข้อมูลเหล่านี้แนะนำอย่างยิ่งว่าออกซิเจนเดี่ยวเป็นออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาหลักที่รับผิดชอบในการติดฉลากโปรตีโอมิกในภายหลังความเป็นพิษต่อเซลล์ของ PDPL ได้รับการประเมินซึ่งรวมถึงการฉายรังสีแสงสีน้ำเงินและหัววัดทางเคมี และไม่พบความเป็นพิษต่อเซลล์ที่มีนัยสำคัญ (รูปที่ 4a เพิ่มเติม)
เพื่อที่จะศึกษากลไกการติดฉลากและเปิดใช้งานการระบุโปรตีนของสารเชิงซ้อนของโปรตีนโดยใช้ LC-MS/MS อันดับแรก เราต้องพิจารณาว่ากรดอะมิโนใดถูกดัดแปลงและมวลเดลต้าของฉลากโพรบมีรายงานว่าเมไทโอนีน ฮิสทิดีน ทริปโตเฟน และไทโรซีนถูกแก้ไขโดยออกซิเจนเดี่ยว 14,15เราผสานรวมเวิร์กโฟลว์ TOP-ABPP31 เข้ากับการค้นหาแบบเปิดที่เป็นกลางจากแพลตฟอร์มการคำนวณ FragPipe ที่ใช้ MSFragger32หลังจากการดัดแปลงออกซิเจนเสื้อกล้ามเดี่ยวและการติดฉลากโพรบเคมี เคมีคลิกถูกดำเนินการโดยใช้ฉลากการลดไบโอตินที่มีตัวเชื่อมโยงที่แยกออกได้ ตามด้วยการทำให้ยืดนิวตราวิดินและการย่อยทริปซินเปปไทด์ที่ถูกดัดแปลง, ยังคงจับกับเรซิน, ถูกโฟโตคลีฟสำหรับการวิเคราะห์ LC-MS/MS (รูปที่ 2a และข้อมูลเสริม 1)การดัดแปลงจำนวนมากเกิดขึ้นทั่วทั้งโปรตีโอมที่มีการจับคู่เปปไทด์มากกว่า 50 รายการ (PSM) ที่แสดงรายการไว้ (รูปที่ 2b)น่าแปลกที่เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงของฮิสทิดีนเท่านั้น อาจเป็นเพราะปฏิกิริยาที่สูงกว่าของฮิสทิดีนที่ถูกออกซิไดซ์ที่มีต่อโพรบอนิลีนมากกว่ากรดอะมิโนอื่นๆตามกลไกการเผยแพร่ของ histidine oxidation โดย singlet oxygen, 21,33 โครงสร้างเดลต้า-mass ที่เสนอคือ +229 Da สอดคล้องกับ adduct ของ probe 3 ที่มี 2-oxo-histidine หลังจากออกซิเดชันสองครั้ง ขณะที่ +247 Da เป็นผลิตภัณฑ์ไฮโดรไลซิส จาก +229 Da (รูปที่ 5 เพิ่มเติม)การประเมินสเปกตรัม MS2 แสดงให้เห็นความน่าเชื่อถือในระดับสูงของการระบุไอออน y และ b ส่วนใหญ่ รวมถึงการระบุไอออนของชิ้นส่วนที่ถูกดัดแปลง (y และ b) (รูปที่ 2c)การวิเคราะห์บริบทของลำดับเฉพาะที่ของฮิสทิดีนที่ดัดแปลงด้วย PDPL เผยให้เห็นความพึงพอใจโมทีฟปานกลางสำหรับเรซิดิวที่ไม่ชอบน้ำขนาดเล็กที่ตำแหน่ง ±1 (รูปที่ 4b เพิ่มเติม)โดยเฉลี่ยแล้ว 1.4 ฮิสทิดีนถูกระบุต่อโปรตีน และตำแหน่งของเครื่องหมายเหล่านี้ถูกกำหนดหาโดยพื้นที่ผิวที่เข้าถึงได้โดยตัวทำละลาย (SASA) และการวิเคราะห์ความพร้อมใช้ตัวทำละลายสัมพัทธ์ (RSA) (รูปที่ 4c,d)
เวิร์กโฟลว์ที่เป็นกลางสำหรับการศึกษาการเลือกที่เหลือโดยใช้แพลตฟอร์มการคำนวณ FragPipe ที่ขับเคลื่อนโดย MSFraggerตัวเชื่อมโยงที่ตัดแยกได้ถูกใช้ในเคมีคลิกเพื่อยอมให้โฟโตคลีเวจของเปปไทด์ที่ถูกดัดแปลงจากเรซินสเตรปทาวิดินมีการเปิดตัวการค้นหาแบบเปิดเพื่อระบุการปรับเปลี่ยนจำนวนมาก รวมถึงสิ่งที่เหลืออยู่ที่เกี่ยวข้องข กำหนดมวลของการดัดแปลงที่เกิดขึ้นทั่วทั้งโปรตีโอมการทำแผนที่เปปไทด์ PSMc MS2 Spectral Annotation ของตำแหน่งฮิสทิดีนที่ถูกดัดแปลงด้วยโพรบ 3 เป็นตัวอย่างที่แสดงให้เห็น ปฏิกิริยาโควาเลนต์กับโพรบ 3 ได้เพิ่ม +229.0938 Da ให้กับกรดอะมิโนที่ถูกดัดแปลงd Mutation assay ใช้ในการทดสอบเครื่องหมาย PDPLPRDX3 (H155A, H225A) และ PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ถูกทรานส์เฟกด้วยพลาสมิดชนิดพันธุ์ป่าสำหรับการตรวจจับการต้านธงe เปปไทด์สังเคราะห์ทำปฏิกิริยากับ miniSOG บริสุทธิ์ต่อหน้าโพรบ 3 และผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องกับ Δm +247 และ +229 ถูกบันทึกไว้ในสเปกตรัม LC-MSf ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนในหลอดทดลอง จำลองด้วย miniSOG-6xHis-tag และ anti-6xHis แอนติบอดีการวิเคราะห์แอนติบอดี (streptavidin-HRP) และ Western blot ที่ต่อต้านเมาส์ของสารเชิงซ้อนแอนติบอดี miniSOG-6xHis/anti-6xHis ที่ติดฉลากด้วยหัววัด 3 ขึ้นอยู่กับเวลาที่สัมผัสกับแสงฉลากสำหรับโปรตีนแต่ละชนิดถูกแสดงออกในน้ำหนักโมเลกุลที่สอดคล้องกัน: สายเบาของแอนติบอดี LC, สายหนักของแอนติบอดี HCการทดลองเหล่านี้ทำซ้ำอย่างอิสระอย่างน้อยสองครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน
สำหรับการตรวจสอบทางชีวเคมีของตำแหน่งการติดฉลาก PRDX3 และ PRDX1 ที่ระบุโดยแมสสเปกโตรเมทรีถูกเปลี่ยนจากฮิสทิดีนเป็นอะลานีนและเปรียบเทียบกับชนิดพันธุ์ป่าในการสอบวิเคราะห์การทรานส์เฟกชันผลลัพธ์ของ PDPL แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ลดการติดฉลากลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2d)ในขณะเดียวกัน ลำดับของเปปไทด์ที่ระบุในการค้นหาแบบเปิดถูกสังเคราะห์และทำปฏิกิริยาในหลอดทดลองด้วย miniSOG ที่บริสุทธิ์ต่อหน้าโพรบ 3 และแสงสีน้ำเงิน ทำให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่มีการเลื่อนมวลเท่ากับ +247 และ +229 Da เมื่อตรวจพบโดย LC-MS (รูปที่ . 2e).).เพื่อทดสอบว่าโปรตีนที่ใกล้เคียงกันสามารถติดฉลากในหลอดทดลองเพื่อตอบสนองต่อการกระตุ้นด้วยแสง miniSOG ได้หรือไม่ เราออกแบบการทดสอบความใกล้ชิดเทียมโดยการทำงานร่วมกันระหว่างโปรตีน miniSOG-6xHis กับโมโนโคลนอลแอนติบอดีต้านโมโนโคลนอลของเขาในหลอดทดลอง (รูปที่ 2f)ในการสอบวิเคราะห์นี้ เราคาดว่าการติดฉลากใกล้เคียงของสายหนักและสายเบาของแอนติบอดีด้วย miniSOGอันที่จริง anti-mouse (รู้จักสายหนักและเบาของ anti-6xHis-labeled antibody) และ streptavidin Western blots แสดง biotinylation ที่แข็งแกร่งของสายหนักและเบาโดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราสังเกตเห็น miniSOG autobiotinylation เนื่องจากแท็ก 6xHis และการเชื่อมโยงระหว่างโซ่ที่มีน้ำหนักเบาและหนัก ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับช่องว่างที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ระหว่างการตอบสนองใกล้เคียงของไลซีนและ 2-oxo-histidineโดยสรุป เราสรุปได้ว่า PDPL แก้ไขฮิสทิดีนในลักษณะที่ขึ้นกับความใกล้ชิด
เป้าหมายต่อไปของเราคือการกำหนดลักษณะของโปรตีนย่อยเพื่อทดสอบความจำเพาะของการติดฉลากในแหล่งกำเนิดดังนั้นเราจึงแสดง miniSOG อย่างเสถียรในนิวเคลียส เมทริกซ์ของไมโตคอนเดรีย หรือเมมเบรน ER ภายนอกของเซลล์ HEK293T (รูปที่ 3a)การวิเคราะห์เรืองแสงเจลเผยให้เห็นแถบที่ติดฉลากจำนวนมากที่ตำแหน่งย่อยสามตำแหน่งรวมทั้งรูปแบบการติดฉลากที่แตกต่างกัน (รูปที่ 3b)การวิเคราะห์ภาพเรืองแสงแสดงความจำเพาะสูงของ PDPL (รูปที่ 3c)เวิร์กโฟลว์ PDPL ถูกตามด้วยปฏิกิริยาคลิกกับสีย้อมโรดามีนเพื่อวาดโครงร่างโปรตีโอมย่อยโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง และสัญญาณ PDPL ถูกจัดกลุ่มด้วย DAPI, ตัวติดตามไมโตคอนเดรีย หรือตัวติดตาม ER ซึ่งยืนยันถึงความเที่ยงตรงสูงของ PDPLสำหรับตำแหน่งออร์แกเนลล์ทั้งสาม การเปรียบเทียบ PDPL กับ TurboID โดยใช้ avidin western blot แบบคู่ขนานแสดงให้เห็นว่า PDPL ถูกระบุว่าเจาะจงมากขึ้นเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่เกี่ยวข้องภายใต้สภาวะของ PDPL แถบที่ติดฉลากมากขึ้นปรากฏขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงโปรตีนที่ติดฉลาก PDPL มากขึ้น (รูปที่ 6a-d เสริม)
การแสดงแผนผังของการติดฉลากโปรตีโอมเฉพาะของออร์แกเนลล์ที่อาศัย miniSOGminiSOG มุ่งเป้าไปที่เมทริกซ์ยลผ่านการหลอมรวมกับกรดอะมิโน 23 ขั้ว N ของมนุษย์ COX4 (ไมโต-miniSOG) นิวเคลียสผ่านการหลอมรวมกับ H2B (นิวเคลียส-miniSOG) และ Sec61β ผ่านด้านไซโตพลาสซึมของเมมเบรน ER (ER-miniSOG ).ข้อบ่งชี้ ได้แก่ การถ่ายภาพเจล การถ่ายภาพคอนโฟคอล และแมสสเปกโตรเมตรีb ภาพเจลที่เป็นตัวแทนของโปรไฟล์ PDPL เฉพาะออร์แกเนลล์สามโปรไฟล์ซีบีบี คูแมสซี่ บริลเลียนท์ บลูc ภาพคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนของเซลล์ HEK293T ซึ่งแสดงออก miniSOG อย่างเสถียรด้วยการแปลตำแหน่งเซลล์ย่อยที่ต่างกันที่ตรวจพบโดยแอนติบอดีที่ติดฉลาก V5 (สีแดง)เครื่องหมาย Subcellular ใช้สำหรับไมโตคอนเดรียและ ER (สีเขียว)เวิร์กโฟลว์ PDPL รวมถึงการตรวจหาโปรตีโอม subcellular ที่ติดฉลาก miniSOG (สีเหลือง) โดยใช้ Cy3-azide click chemistryแถบมาตราส่วน: 10 µmd แปลงภูเขาไฟของโปรตีโอมที่ติดแท็ก PDPL ในออร์แกเนลล์ต่างๆ หาปริมาณโดยการหาปริมาณที่ไม่มีป้ายกำกับ (n = การทดลองทางชีววิทยาอิสระ 3 ครั้ง)การทดสอบ t ของนักเรียนสองหางใช้กับแปลงภูเขาไฟชนิดพันธุ์ป่า HEK293T ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญจะถูกเน้นด้วยสีแดง (p < 0.05 และ >ความแตกต่างของความเข้มไอออน 2 เท่า) โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญจะถูกเน้นด้วยสีแดง (p < 0.05 และ >ความแตกต่างของความเข้มไอออน 2 เท่า) Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности). โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญจะถูกเน้นด้วยสีแดง (p < 0.05 และ > 2 เท่าของความเข้มของไอออน)显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญจะถูกเน้นด้วยสีแดง (p < 0.05 และ > ความแรงของไอออนิกต่างกัน 2 เท่า)โปรตีนที่เกี่ยวข้องที่สำคัญสำหรับ HEK293T-miniSOG แต่ไม่สำคัญสำหรับ HEK293T จะแสดงเป็นสีเขียวe การวิเคราะห์ความจำเพาะของชุดข้อมูลโปรตีโอมิกจากการทดลอง ง.จำนวนโปรตีนที่มีนัยสำคัญทางสถิติทั้งหมดในแต่ละออร์แกเนลล์ (จุดสีแดงและสีเขียว) ถูกทำเครื่องหมายที่ด้านบนฮิสโตแกรมแสดงโปรตีนที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นในออร์แกเนลล์ตาม MitoCarta 3.0 การวิเคราะห์ GO และ A. Ting et alผู้คน.แยกชุดข้อมูลสำหรับไมโตคอนเดรีย นิวเคลียส และ ERการทดลองเหล่านี้ทำซ้ำอย่างอิสระอย่างน้อยสองครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันข้อมูลดิบมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลดิบ
โดยได้รับการสนับสนุนจากเจลและผลการถ่ายภาพ การหาปริมาณแบบไม่มีฉลากถูกใช้เพื่อหาปริมาณโปรตีโอมที่ระบุในแต่ละออร์แกเนลล์ (ข้อมูลเสริม 2)HEK293T ที่ไม่ถูกทรานส์เฟกถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบเพื่อลบเครื่องหมายพื้นหลัง การวิเคราะห์จุดพล็อตภูเขาไฟแสดงโปรตีนที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05 และ >ความเข้มของไอออน 2 เท่า) รวมทั้งโปรตีนซิงเกิลตันที่มีอยู่ในเส้นที่แสดงออก miniSOG เท่านั้น (รูปที่ 3 จุดสีแดงและสีเขียว) การวิเคราะห์จุดพล็อตภูเขาไฟแสดงโปรตีนที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05 และ >ความเข้มของไอออน 2 เท่า) รวมทั้งโปรตีนซิงเกิลตันที่มีอยู่ในเส้นที่แสดงออก miniSOG เท่านั้น (รูปที่ 3 จุดสีแดงและสีเขียว) Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). การวิเคราะห์จุดพล็อตภูเขาไฟแสดงโปรตีนที่อุดมด้วยอย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05 และ >ความเข้มของไอออน 2 เท่า) รวมทั้งโปรตีนเดี่ยวที่มีอยู่ในเส้นที่แสดงออก miniSOG เท่านั้น (รูปที่ 3d, จุดสีแดงและสีเขียว)火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 出 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （ภาพ 3d 红色 绿色点。。。）））)））））) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). การวิเคราะห์จุดพล็อตภูเขาไฟเผยให้เห็นโปรตีนที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05 และ >2x ความแรงของไอออนิก) รวมทั้งโปรตีนตัวเดียวที่มีอยู่ในบรรทัดการแสดงออก miniSOG เท่านั้น (จุดสีแดงและสีเขียวในรูปที่ 3d)เมื่อรวมข้อมูลเหล่านี้ เราระบุโปรตีนเยื่อหุ้มชั้นนอกที่มีนัยสำคัญทางสถิติ 1364, 461 และ 911 ที่มีนัยสำคัญทางสถิติ ไมโทคอนเดรีย และ ER ตามลำดับเพื่อวิเคราะห์ความถูกต้องของ PDPL ที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่น เราใช้ MitoCarta 3.0, การวิเคราะห์ยีน Ontology (GO) และ A. Ting et alชุดข้อมูล 8 ถูกใช้สำหรับไมโตคอนเดรีย นิวเคลียส และ ER เพื่อทดสอบความจำเพาะของออร์แกเนลล์ของโปรตีนที่ตรวจพบ ซึ่งสอดคล้องกับความแม่นยำ 73.4, 78.5 และ 73.0% (รูปที่ 3e)ความจำเพาะของ PDPL ยืนยันว่า PDPL เป็นเครื่องมือในอุดมคติสำหรับการระบุโปรตีโอมจำเพาะของออร์แกเนลล์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การวิเคราะห์แบบซับมิโตคอนเดรียของโปรตีนไมโตคอนเดรียที่ระบุพบว่าโปรตีโอมที่ติดอยู่นั้นส่วนใหญ่กระจายอยู่ในเมทริกซ์และเยื่อหุ้มชั้นใน (226 และ 106 ตามลำดับ) คิดเป็น 91.7% (362) ของจำนวนโปรตีนยลที่ระบุทั้งหมดPDPL ระดับสูงได้รับการยืนยันเพิ่มเติม (รูปที่ 7a เพิ่มเติม)ในทำนองเดียวกัน การวิเคราะห์ภายใต้นิวเคลียร์แสดงให้เห็นว่าโปรตีโอมที่จับได้ส่วนใหญ่กระจายอยู่ในนิวเคลียส นิวคลีโอพลาสซึม และนิวเคลียส (รูปที่ 7b เสริม)การวิเคราะห์โปรตีโอมิกนิวเคลียร์ด้วยเปปไทด์สัญญาณการโลคัลไลเซชันนิวเคลียร์ (3xNLS) แสดงความแม่นยำที่คล้ายคลึงกันกับโครงสร้าง H2B (รูปที่ 7c–h เพิ่มเติม)เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของมาร์คเกอร์ PDPL ลามินินนิวเคลียร์ A ถูกเลือกให้เป็นกับดัก POI7 ที่มีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นอย่างแยกไม่ออกPDPL ระบุโปรตีนที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญ 36 ชนิด โดยในจำนวนนี้มีโปรตีน 12 ชนิด (30.0% รวมทั้งลามิน A) เป็นโปรตีนที่มีปฏิสัมพันธ์กับลามิน A ที่มีลักษณะเฉพาะที่ดีที่บันทึกโดยฐานข้อมูลสตริง โดยมีเปอร์เซ็นต์สูงกว่าวิธี BioID (122 โปรตีน) 28 จาก 28 รายการ , 22.9 %) 7. วิธีการของเราระบุโปรตีนน้อยลง อาจเป็นเพราะพื้นที่การติดฉลากที่จำกัด ซึ่งเป็นไปได้ด้วยออกซิเจนเสื้อกล้ามที่ออกฤทธิ์มากขึ้นการวิเคราะห์ GO พบว่าโปรตีนที่ระบุส่วนใหญ่อยู่ในนิวคลีโอพลาสซึม (26) เยื่อหุ้มนิวเคลียส (10) เยื่อหุ้มนิวเคลียส (9) และรูพรุนของนิวเคลียส (5)โดยรวมแล้ว โปรตีนที่ถูกจำกัดตำแหน่งด้วยนิวเคลียร์เหล่านี้คิดเป็น 80% ของโปรตีนที่ได้รับการเสริมสมรรถนะ ซึ่งแสดงให้เห็นเพิ่มเติมถึงความจำเพาะของ PDPL (รูปที่ 8a–d เสริม)
เมื่อกำหนดความสามารถของ PDPL ในการทำเครื่องหมายระยะใกล้ในออร์แกเนลล์แล้ว เราจึงทดสอบว่าสามารถใช้ PDPL เพื่อวิเคราะห์พันธมิตรที่มีผลผูกพัน POI ได้หรือไม่โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราพยายามที่จะกำหนดการวิเคราะห์ PDPL ของโปรตีน cytosolic ซึ่งถือว่าเป็นเป้าหมายที่ยากกว่าเป้าหมายที่แยกจากเยื่อหุ้มเซลล์เนื่องจากลักษณะไดนามิกสูงของพวกมันโปรตีน bromodomain และ extraterminal (BET) BRD4 ดึงดูดความสนใจของเราสำหรับบทบาทสำคัญในโรคต่างๆ 35, 36 .คอมเพล็กซ์ที่เกิดจาก BRD4 เป็นตัวกระตุ้นการถอดรหัสและเป้าหมายการรักษาที่สำคัญด้วยการควบคุมการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส c-myc และ Wnt5a คิดว่า BRD4 จะเป็นตัวกำหนดสำคัญของมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันแบบมัยอีลอยด์ (AML) มัลติเพิล มัยอีโลมา มะเร็งต่อมน้ำเหลืองเบอร์กิตต์ มะเร็งลำไส้ใหญ่ และโรคที่เกิดจากการอักเสบ 37,38นอกจากนี้ ไวรัสบางชนิดกำหนดเป้าหมาย BRD4 เพื่อควบคุมการถอดรหัสของไวรัสและเซลล์ เช่น papillomavirus, HIV และ SARS-CoV-236,39
ในการทำแผนที่ปฏิสัมพันธ์ของ BRD4 โดยใช้ PDPL เราได้รวม miniSOG เข้ากับไอโซฟอร์ม N- หรือ C-terminal แบบสั้นของ BRD4ผลลัพธ์ของโปรตีโอมิกเผยให้เห็นการทับซ้อนกันในระดับสูงระหว่างโครงสร้างทั้งสอง (รูปที่ 9a เพิ่มเติม)โปรตีโอมนิวเคลียร์ที่ระบุด้วย miniSOG-H2B ครอบคลุม 77.6% ของโปรตีนที่ทำปฏิกิริยากับ BRD4 (รูปที่ 9b เสริม)จากนั้นจึงใช้ช่วงเวลาต่างๆ ของการส่องสว่าง (2, 5, 10, 20 นาที) เพื่อปรับรัศมีของเครื่องหมาย (รูปที่ 4a และข้อมูลเสริม 3)เราสรุปได้ว่าในช่วงแสงที่สั้นกว่า PDPL จะติดฉลากพันธมิตรที่จับโดยตรงเป็นหลัก ในขณะที่ระยะเวลาที่นานขึ้นจะรวมถึงโปรตีนที่ระบุในช่วงระยะเวลาการกระตุ้นด้วยแสงที่สั้นลง เช่นเดียวกับเป้าหมายทางอ้อมในสารเชิงซ้อนสำหรับการติดฉลากอันที่จริง เราพบว่ามีการทับซ้อนกันอย่างมากระหว่างจุดเวลาที่อยู่ติดกัน (84.6% เป็นเวลา 2 และ 5 นาที 87.7% เป็นเวลา 5 และ 10 นาที 98.7% เป็นเวลา 10 และ 20 นาที) (รูปที่ 4b และรูปที่ 9c เพิ่มเติม)ในกลุ่มทดลองทั้งหมด เราพบว่าไม่เพียงแต่ BRD4 self-labeling เท่านั้น แต่ยังมีเป้าหมายที่รู้จักหลายอย่าง เช่น MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A และ HMGB1 ที่มีคำอธิบายประกอบในฐานข้อมูลสตริงความแรงของไอออนิกของเป้าหมายเหล่านี้แปรผันตามเวลาเปิดรับแสง (รูปที่ 4c และรูปที่ 9d เพิ่มเติม)การวิเคราะห์ GO ของโปรตีนที่ระบุในกลุ่ม 2 นาที แสดงให้เห็นว่าโปรตีนที่ระบุถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในนิวเคลียสและเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของโครมาตินและฟังก์ชัน RNA polymeraseหน้าที่ระดับโมเลกุลของโปรตีนถูกทำให้สมบูรณ์ในการจับโครมาตินหรือการโคแอกติเวชันเชิงถอดรหัส ซึ่งสอดคล้องกับฟังก์ชัน BRD4 (รูปที่ 4d)การวิเคราะห์ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนที่เปิดใช้งานฐานข้อมูลสตริงเผยให้เห็นระดับแรกของปฏิกิริยาทางอ้อมระหว่างสารเชิงซ้อนที่มีปฏิสัมพันธ์ในตระกูล BRD4 และ HDAC เช่น SIN3A, NCOR2, BCOR และ SAP130 (รูปที่ 4e และรูปที่ 9e เพิ่มเติม) ซึ่งสอดคล้องกับ BRD4 และ HDAC ที่จับกับ acetylated histones ..นอกจากนี้ เป้าหมายตัวแทนที่ระบุโดย LC-MS/MS ซึ่งรวมถึง Sin3A, NSUN2, Fus และ SFPQ ได้รับการยืนยันโดย Western blotting (รูปที่ 4f)เมื่อเร็วๆ นี้ มีรายงานไอโซฟอร์มสั้นของ BRD4 เพื่อก่อรูปนิวเคลียสที่มีคุณสมบัติการแยกเฟสของเหลวและของเหลว (LLPS)โปรตีนการจับ RNA Fus และ SFPQ เป็นสื่อกลาง LLPS ของกระบวนการเซลล์ต่างๆ และได้รับการระบุในที่นี้เป็นโปรตีนการจับ BRD4 ที่ไม่ได้บันทึกการทำงานร่วมกันระหว่าง BRD4 และ SFPQ ได้รับการยืนยันโดยการทดลองร่วมภูมิคุ้มกัน (co-IP) (รูปที่ 4g) ซึ่งเป็นการแนะนำกลไกอื่นสำหรับการแยกเฟสของเหลวและของเหลวที่เป็นสื่อกลาง BRD4 สมควรได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมเมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า PDPL เป็นแพลตฟอร์มในอุดมคติสำหรับการระบุการโต้ตอบ BRD4 ที่รู้จักและโปรตีนการจับที่ไม่รู้จัก
การแสดงแผนผังของการทำเครื่องหมายความใกล้เคียง BRD4 แบบอาศัย miniSOG เวลาเปิดรับแสง: 2, 5, 10 และ 20 นาทีb การทับซ้อนกันของโปรตีนที่ระบุในช่วงเวลาที่แสงต่างกันการเพิ่มปริมาณโปรตีนที่ระบุใน HEK293T-miniSOG-BRD4 มีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับ HEK293T ชนิดพันธุ์ป่าc ความเข้มข้นของไอออนเมื่อหาปริมาณโปรตีนที่จับกับ BRD4 ที่เป็นตัวแทนที่ไม่มีป้ายกำกับในช่วงเวลาที่กำหนดn = 3 ตัวอย่างอิสระทางชีวภาพข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานd การวิเคราะห์ยีนออนโทโลจี (GO) ของโปรตีนที่ระบุในกลุ่ม 2 นาทีเงื่อนไข GO สิบข้อแรกมีการระบุไว้ฟองอากาศจะถูกระบายสีตามหมวดหมู่คำศัพท์ GO และขนาดฟองจะเป็นสัดส่วนกับจำนวนโปรตีนที่พบในแต่ละเทอมe การวิเคราะห์สตริงของโปรตีนที่มีปฏิสัมพันธ์กับ BRD4วงกลมสีเหลืองคือกาวโดยตรง และวงกลมสีเทาคือชั้นแรกของกาวทางอ้อมเส้นสีแดงแสดงถึงการโต้ตอบที่กำหนดโดยการทดลอง และเส้นสีน้ำเงินแสดงถึงการโต้ตอบที่คาดการณ์ไว้f เป้าหมายการจับ BRD4 ที่เป็นตัวแทนที่ระบุใน LC-MS/MS ถูกตรวจสอบโดย Western blottingg การทดลองร่วมภูมิคุ้มกันยืนยันการทำงานร่วมกันระหว่าง SFPQ และ BRD4การทดลองเหล่านี้ทำซ้ำอย่างอิสระอย่างน้อยสองครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันข้อมูลดิบมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลดิบ
นอกเหนือจากการระบุเป้าหมายที่เกี่ยวข้องกับ POI ที่ไม่ได้ลงทะเบียนแล้ว เราตั้งสมมติฐานว่า PDPL จะเหมาะสำหรับการระบุซับสเตรตสำหรับเอนไซม์ ซึ่งจะต้องมีการกำหนดลักษณะของโปรตีนการจับทางอ้อมในสารเชิงซ้อนขนาดใหญ่เพื่อใส่คำอธิบายประกอบกับซับสเตรตที่ไม่ได้ลงทะเบียนParkin (เข้ารหัสโดย PARK2) เป็น E3 ligase และการกลายพันธุ์ใน parkin เป็นที่รู้กันว่าทำให้เกิดโรคพาร์คินสันเด็กและเยาวชนด้อยคุณภาพ (AR-JP) 42นอกจากนี้ พาร์กินยังได้รับการอธิบายว่าจำเป็นสำหรับไมโทฟาจี (ออโตฟาจีของไมโตคอนเดรีย) และการกำจัดออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาอย่างไรก็ตาม แม้ว่าจะมีการระบุสารตั้งต้นของพาร์กินหลายชนิด แต่บทบาทของพาร์กินในโรคนี้ก็ยังไม่ชัดเจนในการอธิบายพื้นผิวที่ไม่มีลักษณะเฉพาะ PDPL ได้รับการทดสอบโดยการเพิ่ม miniSOG ที่ปลาย N หรือ C ของ parkinเซลล์ถูกบำบัดด้วยตัวขนส่งโปรตอนคาร์บอนิลไซยาไนด์ m-คลอโรฟีนิลไฮดราโซน (CCCP) เพื่อกระตุ้นพาร์คินผ่านทางวิถี PINK1-พาร์กินเมื่อเปรียบเทียบกับผลลัพธ์ BRD4 PDPL ของเราแล้ว การหลอมรวมของปลาย N ของ Parkin เผยให้เห็นชุดโปรตีนเป้าหมายที่ใหญ่กว่า แม้ว่ามันจะครอบคลุมส่วนใหญ่ของปลาย C (177 จาก 210) (รูปที่ 5a,b และข้อมูลเสริม 4)ผลลัพธ์สอดคล้องกับรายงานว่าแท็ก N-terminal สามารถเปิดใช้งาน Parkin44 อย่างผิดปกติน่าแปลกที่ข้อมูลของเรามีโปรตีนทับซ้อนกันเพียง 18 ชนิดพร้อมผลลัพธ์ AP-MS ที่เผยแพร่สำหรับ Parkin43 ซึ่งน่าจะเกิดจากความแตกต่างระหว่างสายเซลล์และเวิร์กโฟลว์โปรตีโอมิกส์นอกเหนือจากโปรตีนที่รู้จักสี่ชนิด (ARDM1, HSPA8, PSMD14 และ PSMC3) ที่ระบุโดยสองวิธี (รูปที่ 5c)43เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของผลลัพธ์ของ LC-MS/MS เพิ่มเติม การบำบัดด้วย PDPL และ Western blotting ที่ตามมาถูกใช้เพื่อเปรียบเทียบผลลัพธ์ของการสอบวิเคราะห์เซลล์ต้นกำเนิด HEK293T และเส้นพาร์กินที่ปลาย N ที่เสถียรเป้าหมายที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้ CDK2, DUT, CTBP1 และ PSMC4 ได้รับการทดสอบด้วยสารยึดเกาะที่รู้จัก DNAJB1 (รูปที่ 5d)
พล็อตภูเขาไฟของโปรตีนที่ทำปฏิกิริยากับพาร์กินในเซลล์ HEK293T ที่มี miniSOG ที่แสดงออกอย่างคงตัวที่หลอมรวมกับปลาย N หรือ C ของพาร์กิน (n = การทดลองทางชีววิทยาอิสระ 3 ครั้ง)การทดสอบ t ของนักเรียนสองหางใช้กับแปลงภูเขาไฟHEK293T ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญจะถูกเน้นด้วยสีแดง (p < 0.05 และ >ความแตกต่างของความเข้มไอออน 2 เท่า) โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญจะถูกเน้นด้วยสีแดง (p < 0.05 และ >ความแตกต่างของความเข้มไอออน 2 เท่า) Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности). โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญจะถูกเน้นด้วยสีแดง (p < 0.05 และ > 2 เท่าของความเข้มของไอออน)显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญจะถูกเน้นด้วยสีแดง (p < 0.05 และ > ความแรงของไอออนิกต่างกัน 2 เท่า)โปรตีนที่เกี่ยวข้องที่สำคัญสำหรับ HEK293T-miniSOG แต่ไม่สำคัญสำหรับ HEK293T จะแสดงเป็นสีเขียวb แผนภาพเวนน์แสดงโปรตีนที่ทับซ้อนกันระหว่างโครงสร้างปลาย N และปลาย Cแท็ก N-terminal สามารถกระตุ้น parkin อย่างผิดปกติและส่งผลให้โปรตีนเป็นที่รู้จักมากขึ้นc แผนภาพเวนน์แสดงโปรตีนที่ทับซ้อนกันระหว่าง PDPL และ AP-MSตัวโต้ตอบที่รู้จักมีการระบุไว้ ซึ่งรวมถึงโปรตีนที่ทับซ้อนกัน 4 จาก 18 รายการและโปรตีน 11 จาก 159 รายการที่ระบุอย่างจำเพาะใน PDPLd เป้าหมายตัวแทนที่ระบุโดย LC-MS/MS ได้รับการยืนยันโดย Western blottinge Ssu72 และ SNW1 ถูกระบุว่าเป็นสารตั้งต้นพาร์กินที่ไม่ได้ลงทะเบียนพลาสมิดโปรตีนที่ติดแท็ก FLAG เหล่านี้ถูกทรานส์เฟกเป็น HEK293T และ HEK293T-Parkin-miniSOG ตามด้วยการบำบัด CCCP ที่จุดเวลาต่างๆความเสื่อมโทรมนั้นเด่นชัดมากขึ้นในบรรทัดการแสดงออกของ Parkinf การใช้ตัวยับยั้งโปรตีอาโซม MG132 ได้รับการยืนยันว่ากระบวนการย่อยสลายของ Ssu72 และ SNW1 เป็นตัวกลางโดยการสร้างโปรทีโอโซม-ยูบิควิเนชันการทดลองเหล่านี้ทำซ้ำอย่างอิสระอย่างน้อยสองครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันข้อมูลดิบมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลดิบ
อย่างน่าสังเกต โปรตีนที่ระบุโดย PDPL ต้องรวมถึงโปรตีนซึ่งจับพาร์คินและซับสเตรตของพวกมันในการตรวจจับซับสเตรตพาร์กินที่ไม่ได้ลงทะเบียน เราเลือกโปรตีนที่ระบุเจ็ดชนิด (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 และ SNW1) และพลาสมิดที่ทรานส์เฟกเพื่อให้ยีนเหล่านี้แสดง HEK293T ปกติและแสดง HEK293T ของ miniSOG-Parkin อย่างเสถียร ตามด้วยการบำบัดด้วย CCCPระดับของโปรตีน Ssu72 และ SNW1 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในสาย miniSOG-Parkin ที่เสถียร (รูปที่ 5e)การบำบัดด้วย CCCP เป็นเวลา 12 ชั่วโมงส่งผลให้เกิดการเสื่อมสภาพที่สำคัญที่สุดของสารตั้งต้นทั้งสองเพื่อตรวจสอบว่าการเสื่อมสลายของ Ssu72 และ SNW1 ถูกควบคุมโดย proteasome-ubiquitination หรือไม่ ได้มีการเพิ่มตัวยับยั้ง proteasome MG132 เพื่อยับยั้งการออกฤทธิ์ของ proteasome และในความเป็นจริง เราพบว่ากระบวนการย่อยสลายของพวกมันถูกยับยั้ง (รูปที่ 5f)เป้าหมายที่ไม่ใช่สารตั้งต้นเพิ่มเติมได้รับการยืนยันในฐานะตัวโต้ตอบ Parkin โดยใช้ Western blotting (รูปที่ 10 เพิ่มเติม) ซึ่งแสดงผลลัพธ์ที่สอดคล้องกับ LC-MS/MSโดยสรุป การรวมเวิร์กโฟลว์ PDPL กับการตรวจสอบยืนยันการถ่ายโปรตีนเป้าหมายช่วยให้สามารถระบุซับสเตรต E3 ligase ที่ไม่ได้ลงทะเบียนได้
เราได้พัฒนาแพลตฟอร์มการทำเครื่องหมายระยะใกล้ทั่วไปที่ช่วยให้คุณระบุ POI ที่มีการโต้ตอบในอวกาศและเวลาได้แพลตฟอร์มนี้ใช้โปรตีนไวแสง miniSOG ซึ่งมีขนาดเพียง 12 kDa ซึ่งน้อยกว่าครึ่งหนึ่งของขนาดของเอนไซม์ APEX2 ที่โตเต็มที่ (27 kDa) และขนาดหนึ่งในสามของ TurboID (35 kDa)ขนาดที่เล็กกว่าควรขยายขอบเขตการใช้งานอย่างมากสำหรับการศึกษาปฏิกิริยาโต้ตอบของโปรตีนขนาดเล็กจำเป็นต้องมีการสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับสารกระตุ้นแสงเพิ่มเติม ไม่ว่าจะเป็นโปรตีนที่เข้ารหัสทางพันธุกรรมหรือโมเลกุลขนาดเล็ก เพื่อเพิ่มผลผลิตควอนตัมของออกซิเจนเดี่ยวและขยายความไวของวิธีการนี้สำหรับ miniSOG เวอร์ชันปัจจุบัน ความละเอียดชั่วขณะสูงสามารถทำได้โดยใช้ไฟสีน้ำเงินเพื่อเปิดใช้งานตัวทำเครื่องหมายระยะใกล้นอกจากนี้ เวลาเปิดรับแสงนานขึ้นจะปล่อย “ก้อนเมฆ” ที่ใหญ่ขึ้นของออกซิเจนเดี่ยว ส่งผลให้เกิดการดัดแปลงของฮิสทิดีนเรซิดิวส่วนปลายมากขึ้น เพิ่มรัศมีการติดฉลาก และความสามารถในการปรับแต่งความละเอียดเชิงพื้นที่ PDPLนอกจากนี้เรายังทดสอบโพรบเคมีเจ็ดตัวเพื่อเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อพื้นหลัง และสำรวจกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลังแนวทางนี้เวิร์กโฟลว์ TOP-ABPP รวมกับการค้นหาแบบเปิดที่เป็นกลางยืนยันว่าการดัดแปลงเกิดขึ้นเฉพาะในฮิสทิดีนและไม่พบสภาพแวดล้อมจุลภาคที่สอดคล้องกันสำหรับการปรับเปลี่ยนฮิสทิดีนที่เพิ่มขึ้น ยกเว้นการตั้งค่าระดับปานกลางสำหรับฮิสทิดีนในบริเวณลูป
PDPL ยังถูกใช้เพื่อกำหนดลักษณะเฉพาะของโปรตีโอมย่อยที่มีความจำเพาะของโปรตีโอมและความครอบคลุมอย่างน้อยเทียบได้กับการติดฉลากความใกล้เคียงอื่นๆ และวิธีการตรวจสอบสารเคมีที่จำเพาะของออร์แกเนลล์พรอกซิมิตีมาร์กเกอร์ยังถูกนำมาใช้อย่างประสบความสำเร็จในการจำแนกลักษณะพื้นผิว โปรตีโอมที่เกี่ยวข้องกับไลโซโซมและสารคัดหลั่ง46,47เราเชื่อว่า PDPL จะเข้ากันได้กับออร์แกเนลล์ย่อยเซลล์เหล่านี้นอกจากนี้ เราท้าทาย PDPL โดยการระบุเป้าหมายสำหรับการจับโปรตีน cytosolic ที่ซับซ้อนกว่าโปรตีนที่จับกับเมมเบรนเนื่องจากคุณสมบัติไดนามิกของพวกมันและการมีส่วนร่วมในอันตรกิริยาชั่วคราวมากกว่าPDPL ถูกนำไปใช้กับโปรตีนสองชนิด ได้แก่ สารกระตุ้นการถอดรหัส BRD4 และ ligase E3 Parkin ที่เกี่ยวข้องกับโรคโปรตีนทั้งสองนี้ได้รับการคัดเลือกไม่เพียงแต่สำหรับหน้าที่ทางชีววิทยาพื้นฐานของพวกมันเท่านั้น แต่ยังรวมถึงความเกี่ยวข้องทางคลินิกและศักยภาพในการรักษาด้วยสำหรับ POI ทั้งสองนี้ มีการระบุพันธมิตรที่มีผลผูกพันที่รู้จักกันดีรวมถึงเป้าหมายที่ไม่ได้ลงทะเบียนโดยเฉพาะอย่างยิ่ง โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการแยกเฟส SFPQ ได้รับการยืนยันโดย co-IP ซึ่งอาจบ่งชี้ถึงกลไกใหม่โดยที่ BRD4 (ไอโซฟอร์มสั้น) ควบคุม LLPSในเวลาเดียวกัน เราเชื่อว่าการระบุพื้นผิว Parkin เป็นสถานการณ์ที่จำเป็นต้องมีการระบุกาวทางอ้อมเราระบุซับสเตรตพาร์กินที่ไม่ปรากฏชื่อสองชนิดและยืนยันการเสื่อมสภาพของพวกมันตามวิถีการแพร่หลาย-โปรตีโอโซมเมื่อเร็ว ๆ นี้ กลยุทธ์การดักจับตามกลไกได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อตรวจจับซับสเตรตไฮโดรเลสโดยการดักจับพวกมันด้วยเอนไซม์แม้ว่านี่จะเป็นวิธีที่ทรงพลังมาก แต่ก็ไม่เหมาะสำหรับการวิเคราะห์พื้นผิวที่เกี่ยวข้องกับการก่อตัวของสารเชิงซ้อนขนาดใหญ่และต้องการการก่อตัวของพันธะโควาเลนต์ระหว่างเอนไซม์กับสารตั้งต้นเราคาดหวังว่า PDPL สามารถขยายเพื่อศึกษาโปรตีนเชิงซ้อนและตระกูลของเอนไซม์อื่นๆ เช่น ตระกูล deubiquitinase และ metalloprotease
รูปแบบใหม่ของ miniSOG ที่เรียกว่า SOPP3 ได้รับการพัฒนาด้วยการผลิตออกซิเจนเดี่ยวที่ได้รับการปรับปรุงเราเปรียบเทียบ miniSOG กับ SOPP3 และพบว่าประสิทธิภาพการมาร์กดีขึ้น แม้ว่าอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 11 เพิ่มเติม)เราตั้งสมมติฐานว่าการปรับ SOPP3 ให้เหมาะสมที่สุด (เช่น ผ่านวิวัฒนาการโดยตรง) จะนำไปสู่โปรตีนไวแสงที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นซึ่งต้องใช้เวลาแสงที่สั้นลง และทำให้สามารถจับกระบวนการเซลล์แบบไดนามิกมากขึ้นได้โดยเฉพาะอย่างยิ่ง PDPL เวอร์ชันปัจจุบันจำกัดอยู่ที่สภาพแวดล้อมของเซลล์ เนื่องจากต้องใช้แสงสีน้ำเงินและไม่สามารถเจาะเนื้อเยื่อลึกได้คุณลักษณะนี้ห้ามไม่ให้ใช้ในการศึกษาแบบจำลองสัตว์อย่างไรก็ตาม การผสมผสานระหว่างออพโตเจเนติกส์กับ PDPL อาจเป็นโอกาสสำหรับการวิจัยในสัตว์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสมองนอกจากนี้ สารไวแสงอินฟราเรดที่ออกแบบทางวิศวกรรมอื่นๆ ยังขจัดข้อจำกัดนี้ด้วยการวิจัยกำลังดำเนินการในพื้นที่นี้
สายเซลล์ HEK293T ได้มาจาก ATCC (CRL-3216)สายพันธุ์ของเซลล์ทดสอบการติดเชื้อมัยโคพลาสม่าเป็นลบ และเพาะเลี้ยงใน DMEM (Thermo, #C11995500BT) ที่เสริมด้วยซีรัมของตัวอ่อนในครรภ์ 10% (FBS, Vistech, #SE100-B) และเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 1% (Hyclone, #SV30010)เติบโตใน
ซื้อ 3-Aminophenylene (ตัวอย่างที่ 3) และ (4-ethynylphenyl)methanamine (ตัวอย่างที่ 4) จาก BidepharmPropylamine (probe 2) ซื้อมาจาก Energy-chemicalsN-(2-อะมิโนฟีนิล)เพน-4-อินาไมด์ (โพรบ 1) ถูกสังเคราะห์ตามวิธีการที่เผยแพร่
ตารางเสริม 1 แสดงโครงสร้างทางพันธุกรรมที่ใช้ในการศึกษานี้ลำดับ miniSOG และ KillerRed ถูกโคลนจากพลาสมิดของขวัญจาก P. Zou (มหาวิทยาลัยปักกิ่ง)ลำดับการกำหนดเป้าหมายเมทริกซ์ของไมโตคอนเดรียได้มาจากกรดอะมิโนที่ปลาย N 23 ตัวของ COX4 และโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ที่ระบุโดยใช้ชุดประกอบกิบสัน (Beyotime, #D7010S)เพื่อกำหนดเป้าหมายเมมเบรนและนิวเคลียสของเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม DNA ของมนุษย์ SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ขยายโดย PCR จากคลัง cDNA ของเซลล์ HEK293T และ DNA H2B (บริจาคโดย D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) และโคลนตามที่กล่าวไว้ข้างต้นเว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ยีนโปรตีนอื่นๆ ที่ใช้สำหรับการทรานส์เฟกและการสร้างสายพันธุ์ของเซลล์ที่เสถียรถูกขยาย PCR จากคลัง cDNA ของเซลล์ HEK293TG3S (GGGS) และ G4S (GGGGS) ถูกใช้เป็นตัวเชื่อมระหว่างโปรตีนของเหยื่อและ miniSOGแท็กอีพิโทป V5 (GKPIPNPLLGLDST) ถูกเพิ่มไปยังโครงสร้างการหลอมรวมเหล่านี้สำหรับการแสดงออกในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและเพื่อสร้างสายเซลล์ที่เสถียร โครงสร้างหลอมรวม miniSOG ถูกคัดลอกย่อยไปในเวกเตอร์เลนติไวรัส pLX304สำหรับการแสดงออกของแบคทีเรีย miniSOG ถูกโคลนลงในเวกเตอร์ pET21a ที่ติดฉลาก 6xHis ที่ปลาย C
เซลล์ HEK293T ถูกเพาะที่เซลล์ 2.0 x 105 ต่อหลุมในเพลตแบบหกหลุม และถูกทรานส์เฟก 24 ชั่วโมงต่อมาด้วยรีคอมบิแนนท์เลนติไวรัสพลาสมิด (2.4 ไมโครกรัม pLX304) และพลาสมิดบรรจุภัณฑ์ไวรัส (1.5 ไมโครกรัม psPAX2 และ 1.2 ไมโครกรัม pMD2.G) ด้วยการใช้ Lipo8000 (บีโยไทม์) , #C0533) การหลอมรวมประมาณ 80%หลังจากการถ่ายข้ามคืน สื่อถูกเปลี่ยนและฟักต่อไปอีก 24 ชั่วโมงการรวบรวมไวรัสได้ดำเนินการหลังจาก 24, 48 และ 72 ชั่วโมงก่อนการติดเชื้อในสายพันธุ์ของเซลล์เป้าหมาย สื่อของไวรัสถูกกรองผ่านตัวกรอง 0.8 ไมโครเมตร (เมอร์ค, #millex-GP) และพอลิเบรน (Solarbio, #H8761) ถูกเติมลงในความเข้มข้น 8 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรหลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง เซลล์สามารถฟื้นตัวได้โดยการเปลี่ยนตัวกลางเซลล์ถูกเลือกโดยใช้บลาสซิซิดิน 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (Solarbio, #3513-03-9) สำหรับสามทางแรกเป็นการเลือกที่เข้มงวดต่ำกว่าจากนั้นใช้ 20 ไมโครกรัม/มล. เพื่อเป็นการรักษาที่เข้มงวดยิ่งขึ้นสำหรับสามข้อความถัดไป
เซลล์ถูกเพาะในห้อง 12 หลุม (Ibidi, #81201) ที่ความหนาแน่นประมาณ 20,000 เซลล์ต่อหลุมเพื่อปรับปรุงการยึดเกาะของเซลล์ HEK293T ให้เติมไฟโบรเนกติน 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (Corning, #356008) ที่เจือจางในน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟต (PBS, Sangon, #B640435) ที่ 37°Cห้องถูกปรับสภาพก่อนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงแล้วจึงนำออกด้วย PBSหลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกล้างด้วย PBS หนึ่งครั้ง บ่มด้วยโพรบ 3 มิลลิโมลาร์ 3 ในสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์สด (HBSS, Gibco, #14025092) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37°C จากนั้นจึงบ่มด้วยไฟ LED สีน้ำเงิน (460 นาโนเมตร) ).) ถูกฉายรังสีเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องหลังจากนั้น เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS และตรึงด้วยฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ใน PBS (Sangon, #E672002) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องฟอร์มาลดีไฮด์ส่วนเกินถูกกำจัดออกจากเซลล์ที่ตายตัวโดยการล้างด้วย PBS สามครั้งจากนั้นเซลล์ถูกทำให้ซึมผ่านด้วย 0.5% ไทรทัน X-100 (Sangon, #A600198) ใน PBS และล้าง 3 ครั้งด้วย PBSจากนั้นนำห้องออกและเพิ่มไปยังตัวอย่างแต่ละตัวอย่าง 25 µl ของของผสมปฏิกิริยาคลิกที่มี 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) และโซเดียมแอสคอร์เบต 0.5 มก./มล. (อะลาดินหมายเลข S105024) และบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องหลังจากเกิดปฏิกิริยาอย่างรวดเร็ว เซลล์ถูกล้างหกครั้งด้วย PBS ที่มี 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) และจากนั้นถูกบล็อกด้วย 5% BSA (Abcone, #B24726) ใน PBST เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
สำหรับการสร้างภูมิคุ้มกันการโคโลคัลไลเซชัน เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิตามเงื่อนไขที่ระบุ: แท็กต้าน V5 ของเมาส์ mAb (1:500, CST, #80076), กระต่ายต้าน Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), โพลีโคลนัลแอนติ-calnexin แอนติบอดีสำหรับกระต่าย (1:500, Abcam, #ab22595) หรือโมโนโคลนอลแอนติบอดี A/C ที่ต้านลามินของกระต่าย (1:500; CST, #2032) ที่ 4 °C ค้างคืนหลังจากล้างด้วย PBST 3 ครั้ง เซลล์จะถูกฟักด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ: แพะต้านกระต่าย Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) เจือจาง 1:1000, สารต่อต้านหนูเมาส์ Alexa Fluor 594 (CST, #8889) เจือจาง 1:1000เจือจาง เจือจางที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีจากนั้นเซลล์ถูกล้าง 3 ครั้งด้วย PBST และย้อมเคาน์เตอร์ด้วย DAPI (Thermo, #D1306) ใน PBS เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องหลังจากล้าง 3 ครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกผนึกในกลีเซอรอล 50% (Sangon, #A600232) ใน PBS สำหรับการสร้างภาพได้ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ZEISS LSM 900 Airyscan2 และซอฟต์แวร์ ZNE 3.5
สำหรับการถ่ายภาพด้วยออกซิเจนฟลูออเรสเซนต์เดี่ยว เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ Hanks HEPES ก่อนเติม 100 nM Si-DMA ในบัฟเฟอร์ Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05)หลังจากการสัมผัสกับแสง เซลล์ถูกบ่มในตู้อบ CO2 ที่ 37°C เป็นเวลา 45 นาทีเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ HEPES ของ Hanks และย้อมสีด้วย Hoechst ในบัฟเฟอร์ HEPES ของ Hanks เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องและแสดงภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ZEISS LSM 900, #M36008) ในบัฟเฟอร์ HBSS ที่มีแคลเซียมและแมกนีเซียมหลังจากการสัมผัสกับแสงหรือโดโซรูบิซิน (MCE, #HY-15142A) เซลล์ถูกบ่มในตู้อบ CO2 ที่ 37° C เป็นเวลา 10 นาที ล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ HBSS และบ่มด้วย Hoechst ในบัฟเฟอร์ HBSS ที่อุณหภูมิห้องนาที.ด็อกโซรูบิซินถูกใช้เป็นตัวควบคุมโพรบเชิงบวก โดยที่เซลล์ถูกบำบัดด้วยด็อกโซรูบิซิน 20 ไมโครโมลาร์ใน HBSS ที่มี 1% BSA เป็นเวลา 30 นาทีได้ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล Zeiss LSM 900
เซลล์ HEK293T ซึ่งแสดงออกไมโต-miniSOG อย่างคงตัวถูกเพาะที่ความหนาแน่นประมาณ 30% ในจานขนาด 15 ซม.หลังจาก 48 ชั่วโมง เมื่อถึงการบรรจบกัน ~80% เซลล์ถูกล้างหนึ่งครั้งด้วย PBS บ่มด้วยโพรบ 3 ขนาด 1 มิลลิโมลาร์ในบัฟเฟอร์ HBSS สดเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37°C จากนั้นจึงส่องสว่างด้วยไฟ LED สีฟ้าเป็นเวลา 10 นาทีที่ห้อง อุณหภูมิ..หลังจากนั้น เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS ขูดและแขวนลอยอีกครั้งในบัฟเฟอร์ PBS ที่เย็นจัดซึ่งมีสารยับยั้งโพรทีเอสที่ปราศจาก EDTA (MCE, #HY-K0011)เซลล์ถูกสลายโดยโซนิเคตส่วนปลายเป็นเวลา 1 นาที (เปิด 1 วินาทีและลดลง 1 วินาทีที่แอมพลิจูด 35%)ของผสมที่เป็นผลลัพธ์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15,871 xg เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C เพื่อขจัดเศษซาก และความเข้มข้นของส่วนลอยเหนือตะกอนถูกปรับเป็น 4 มก./มล. โดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA (Beyotime, #P0009)รวมไลเซทด้านบน 1 มล. กับไบโอตินเอไซด์ที่ย่อยสลายได้ด้วยแสง 0.1 มิลลิโมลาร์ (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 มิลลิโมลาร์ (Sangon, #A600974), 0.1 มิลลิโมลาร์ TBTA ลิแกนด์ (อะลาดิน, #T162437) และตู้อบ CuSO4 ขนาด 1 มิลลิโมลาร์ที่มีก้น หมุนขึ้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องหลังจากเกิดปฏิกิริยาทันทีทันใด ให้เติมส่วนผสมลงในสารละลายผสมล่วงหน้า (MeOH:CHCl3:H2O = 4 มล.:1 มล.:3 มล.) ในขวดแก้วขนาด 10 มล.ตัวอย่างถูกผสมและหมุนเหวี่ยงที่ 4500 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องสารละลายด้านล่างและด้านบนถูกทิ้ง ตะกอนถูกล้างสองครั้งด้วยเมทานอล 1 มล. และหมุนเหวี่ยงที่ 15871×g เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4°Cเติมยูเรีย 8 M (อะลาดิน หมายเลข U111902) 1 มล. ลงในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 25 มิลลิโมลาร์ (ABC, Aladdin หมายเลข A110539) เพื่อละลายตะกอนตัวอย่างถูกสร้างใหม่ด้วยไดไทโอทรีทอล 10 มิลลิโมลาร์ (Sangon, #A100281 ใน 25 มิลลิโมลาร์ ABC) เป็นเวลา 40 นาทีที่ 55°C ที่ตามด้วยการเติมไอโอโดอะซีตาไมด์สด 15 มิลลิโมลาร์ (Sangon, #A600539) ที่อุณหภูมิห้องในความมืดอัลคิเลชั่นภายใน 30 นาที.เติมไดไทโอไทรอิทอลเพิ่มเติม 5 มิลลิโมลาร์เพื่อหยุดปฏิกิริยาเตรียมเม็ดบีด agarose NeutrAvidin ประมาณ 100 µl (Thermo, #29202) สำหรับแต่ละตัวอย่างโดยล้าง 3 ครั้งด้วย PBS 1 มล.สารละลายโปรตีโอมข้างต้นถูกเจือจางด้วย PBS 5 มล. และบ่มด้วยเม็ดบีดอากาโรส NeutrAvidin ที่ล้างล่วงหน้าเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องจากนั้นล้างลูกปัด 3 ครั้งด้วย PBS 5 มล. ที่มี SDS 0.2% (Sangon, #A600485), 3 ครั้งด้วย PBS 5 มล. ที่มียูเรีย 1M และ 3 ครั้งด้วย ddH2O 5 มล.จากนั้น เม็ดบีดถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงและแขวนตะกอนอีกครั้งใน 200 ไมโครลิตรของ 25 มิลลิโมลาร์ ABC ที่มียูเรีย 1 โมลาร์, 1 มิลลิโมลาร์ CaCl 2 (แมคลิน, #C805228) และทริปซิน 20 นาโนกรัม/ไมโครลิตร (โพรเมกา, #V5280)ทริปซิไนซ์ค้างคืนที่อุณหภูมิ 37°C โดยหมุนปฏิกิริยาหยุดโดยการเติมกรดฟอร์มิก (Thermo, # A117-50) จนกระทั่ง pH ถึง 2-3ล้างลูกปัด 3 ครั้งด้วย PBS 1 มล. ที่มี SDS 0.2% 3 ครั้งด้วย PBS 1 มล. ที่มียูเรีย 1 M และจากนั้น 3 ครั้งด้วยน้ำกลั่น 1 มล.เปปไทด์ที่ถูกดัดแปลงถูกปลดปล่อยโดย light lysis (365 นาโนเมตร) เป็นเวลา 90 นาทีโดยใช้ 200 ไมโครลิตรของ 70% MeOHหลังจากการปั่นเหวี่ยงจากนั้นล้างลูกปัดด้วย 100 ไมโครลิตรของ 70% MeOH และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวมเข้าด้วยกันตัวอย่างถูกทำให้แห้งในหัวสุญญากาศ Speedvac และเก็บไว้ที่ -20°C จนกระทั่งทำการวิเคราะห์
เพื่อระบุและหาปริมาณเปปไทด์ดัดแปลงด้วยออกซิเจนสายเดี่ยว ตัวอย่างถูกละลายซ้ำในกรดฟอร์มิก 0.1% และเปปไทด์ 1 ไมโครกรัมถูกวิเคราะห์โดยใช้เครื่องวิเคราะห์มวลสาร Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ที่ติดตั้งแหล่งกำเนิด nano ESI จาก Tune และ Xcalibur จากซอฟต์แวร์ผู้จำหน่าย 4.3ตัวอย่างถูกแยกบนคอลัมน์ของเส้นเลือดฝอยที่บรรจุภายใน 75 µm × 15 ซม. ด้วยวัสดุ C18 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9) และเชื่อมต่อกับระบบ EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo)เปปไทด์ถูกแยกออกโดยเกรเดียนท์โครมาโตกราฟีแบบเส้นตรง 95 นาทีจากตัวทำละลาย B 8% ถึงตัวทำละลาย B 50% (A = กรดฟอร์มิก 0.1% ในน้ำ, B = กรดฟอร์มิก 0.1% ในอะซีโตไนไตรล์ 80%) จากนั้นจึงเพิ่มเป็นเส้นตรงเป็น 98% ขั้นต่ำ B ใน 6 นาทีที่อัตราการไหล 300 nl/minOrbitrap Fusion Lumos รวบรวมข้อมูลสลับกันระหว่างการสแกน MS แบบเต็มและการสแกน MS2 ขึ้นอยู่กับข้อมูลแรงดันสปัตเตอร์ถูกตั้งไว้ที่ 2.1 kV และอุณหภูมิของเส้นเลือดฝอยสำหรับการขนส่งไอออนคือ 320 องศาเซลเซียสMS spectra (350-2000 m/z) ถูกรวบรวมด้วยความละเอียด 120,000, AGC 4 × 105 และเวลาอินพุตสูงสุด 150 msสารตั้งต้นที่มีประจุแบบทวีคูณที่พบบ่อยที่สุด 10 ตัวในการสแกนแบบเต็มแต่ละครั้งถูกแยกส่วนโดยใช้ HCD ที่มีพลังงานการชนกันที่ทำให้เป็นมาตรฐาน 30% หน้าต่างการแยกสี่ส่วน 1.6 ม./z และการตั้งค่าความละเอียด 30,000เป้าหมาย AGC สำหรับแมสสเปกโตรเมตรีแบบตีคู่โดยใช้ 5×104 และเวลาอินพุตสูงสุด 150 มิลลิวินาทีข้อยกเว้นแบบไดนามิกถูกตั้งค่าเป็น 30 วินาที ไอออนที่ไม่ได้กำหนดหรือประจุที่มีประจุ 1+ และ >7+ ถูกปฏิเสธสำหรับ MS/MS ไอออนที่ไม่ได้กำหนดหรือประจุที่มีประจุ 1+ และ >7+ ถูกปฏิเสธสำหรับ MS/MS Неназначенные ионы ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. ไอออนหรือไอออนที่ไม่ได้กำหนดที่มีประจุ 1+ และ >7+ ถูกปฏิเสธสำหรับ MS/MS未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. ไอออนหรือไอออนที่ไม่ระบุรายละเอียดที่มีประจุ 1+ และ >7+ ถูกปฏิเสธสำหรับ MS/MS
ข้อมูลดิบถูกประมวลผลโดยใช้แพลตฟอร์มการคำนวณ FragPipe ตาม MSFraggerอคติมวลและกรดอะมิโนที่สอดคล้องกันถูกกำหนดหาโดยใช้อัลกอริธึมการค้นหาแบบเปิดที่มีความทนทานต่อมวลสารตั้งต้นที่ -150 ถึง 500 Daเปปไทด์ดัดแปลงจากนั้นระบุโดยใช้การดัดแปลงฮิสทิดีนด้วยมวลที่เพิ่มขึ้นเป็น +229.0964 และ +247.1069 Da ใน PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo)
เซลล์ที่แสดงยีน miniSOG ที่หลอมละลายได้อย่างเสถียรนั้นถูกชุบในจานขนาด 6 ซม.เมื่อไปถึงจุดบรรจบกัน ~80% เซลล์ถูกล้างหนึ่งครั้งด้วย HBSS (Gibco, #14025092) จากนั้นบ่มด้วยหัววัดทางเคมีใน HBSS เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37°C และส่องสว่างด้วยแสงสีน้ำเงินไฟ LED 10W เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อตรวจสอบว่าชนิดของออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาเกี่ยวข้องกับ PDPL, 0.5 mM วิตามินซี (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , แมนนิทอล 100 มิลลิโมลาร์ (เคมีพลังงาน, #69-65-8), 100 ไมโครโมลาร์ H2O2, 10 มิลลิโมลาร์ NaN3 ถูกเติมไปยังเซลล์ในลักษณะอาหารเสริมหลังจากการล้างด้วย PBS แบบเย็น เซลล์ถูกขูด รวบรวมในหลอดสำหรับการปั่นแยก 1.5 มล. และโซนิเคตด้วยปลายเป็นเวลา 1 นาทีใน 200 ไมโครลิตรของ PBS ด้วยตัวยับยั้งโปรตีเอส 1x ที่ไม่มี EDTA (1 วินาทีและ 1 วินาทีโดยไม่มีแอมพลิจูด 35%)ของผสมที่เป็นผลลัพธ์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15,871 × g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 °C และความเข้มข้นของส่วนลอยเหนือตะกอนถูกปรับเป็น 1 มก./มล. โดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCAไลเซทข้างต้นประมาณ 50 ไมโครลิตรถูกบ่มด้วยโรดามีนเอไซด์ 0.1 มิลลิโมลาร์ (อะลาดิน, หมายเลข T131368), TCEP 1 มิลลิโมลาร์, ลิแกนด์ TBTA 0.1 มิลลิโมลาร์, และ CuSO4 1 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยหมุนจากล่างขึ้นบนหลังจากปฏิกิริยาคลิก การตกตะกอนด้วยอะซิโตนถูกดำเนินการโดยการเพิ่มอะซิโตนที่แช่เย็นไว้ล่วงหน้า 250 ไมโครลิตรลงในตัวอย่าง บ่มที่ -20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที และปั่นแยกที่ 6010×g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°ซรวบรวมเม็ดและต้มใน 50 µl ของ 1x Laemmli's buffer เป็นเวลา 10 นาที ที่ 95 °Cจากนั้นทำการวิเคราะห์ตัวอย่างบนเจลแบบยาว SDS-PAGE และแสดงภาพโดยใช้ระบบสร้างภาพ Bio-rad ChemiDoc MP Touch พร้อมซอฟต์แวร์ Image Lab Touch
การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีน miniSOG-6xHis ลูกผสมถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยสรุป เซลล์ E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) ถูกทรานส์ฟอร์มด้วย pET21a-miniSOG-6xHis และการแสดงออกของโปรตีนถูกเหนี่ยวนำด้วย 0.5 มิลลิโมลาร์ IPTG (Sangon, #A600168)หลังจากการสลายเซลล์ โปรตีนถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เม็ดบีด agarose Ni-NTA (MCE, หมายเลข 70666), ฟอกไตต้าน PBS และเก็บไว้ที่ –80°C
สำหรับการทดสอบความใกล้เคียงของฉลากในหลอดทดลองที่มีแอนติบอดีเป็นพื้นฐาน ให้ผสม miniSOG บริสุทธิ์ 100 ไมโครโมลาร์, โพรบ 3 1 มิลลิโมลาร์ 3 และโมโนโคลนัลแอนติบอดีเมาส์ต้านฉลาก 1 ไมโครกรัม (TransGen, #HT501-01) ใน PBS กับปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด 50 ไมโครลิตร.ของผสมของปฏิกิริยาถูกฉายรังสีด้วยไฟ LED สีน้ำเงินเป็นเวลา 0, 2, 5, 10 และ 20 นาทีที่อุณหภูมิห้องของผสมถูกบ่มด้วย 0.1 มิลลิโมลาร์ไบโอติน-PEG3-เอไซด์ (อะลาดิน, #B122225), 1 มิลลิโมลาร์ TCEP, 0.1 มิลลิโมลาร์ TBTA ลิแกนด์ และ 1 มิลลิโมลาร์ CuSO4 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องบนเครื่องเขย่าขึ้นด้านบนหลังจากเกิดปฏิกิริยาอย่างรวดเร็ว ให้เติมบัฟเฟอร์แหลมลี 4x ลงในส่วนผสมโดยตรง แล้วต้มที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 10 นาทีตัวอย่างถูกวิเคราะห์บนเจล SDS-PAGE และวิเคราะห์โดย western blotting ด้วย streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068)
เปปไทด์สังเคราะห์ที่ประกอบด้วยฮิสทิดีนที่มีอะมิเดชันที่ปลาย C (LHDALDAK-CONH2) ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์การติดฉลากในหลอดทดลองที่มีเปปไทด์ในบริเวณใกล้เคียงในการสอบวิเคราะห์นี้ miniSOG บริสุทธิ์ 100 ไมโครโมลาร์, โพรบ 10 มิลลิโมลาร์ 3 และเปปไทด์สังเคราะห์ 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรถูกผสมใน PBS ในปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด 50 ไมโครลิตรของผสมของปฏิกิริยาถูกฉายรังสีด้วยไฟ LED สีน้ำเงินเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องตัวอย่างหนึ่งไมโครลิตรถูกวิเคราะห์โดยใช้ระบบ LC-MS (น้ำ, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight แมสสเปกโตรมิเตอร์พร้อมซอฟต์แวร์วิเคราะห์สเปกตรัม MassLynx)
เซลล์ HEK293T ที่แสดงยีนฟิวชัน miniSOG ได้อย่างเสถียรนั้นถูกเพาะในจานขนาด 10 ซม. สำหรับสายพันธุ์ที่มีการแปลภาษาของออร์แกเนลล์ต่างกัน (Mito, ER, นิวเคลียส) และจานขนาด 15 ซม. สำหรับสายพันธุ์ Parkin-miniSOG และ BRD4-miniSOGเมื่อไปถึงการบรรจบกัน ~90% เซลล์ถูกล้างหนึ่งครั้งด้วย HBSS จากนั้นจึงฟักด้วยโพรบ 3 ใน HBSS เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37°C และส่องสว่างด้วย LED สีน้ำเงิน 10 วัตต์ที่อุณหภูมิห้องสำหรับการติดฉลากแบบไม่สัมผัสของ Parkin ตัวพาโปรตอนคาร์บอนิลไซยาไนด์ 10 µM m-คลอโรฟีนิลไฮดราโซน CCCP (Solarbio, #C6700) ที่มีโพรบ 3 ใน HBSS ถูกเติมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37°Cขั้นตอนการแยกเซลล์, เคมีคลิก, รีดักชันและอัลคิเลชันเหมือนกันกับที่อธิบายไว้ข้างต้น ยกเว้นว่าไลเสต 2 มก. ถูกเติมและไบโอติน PEG3 เอไซด์ถูกใช้ในปฏิกิริยาคลิกแทนไบโอติน เอไซด์ที่ย่อยสลายได้ด้วยแสงหลังจากการเสริมสมรรถนะ ลูกปัดถูกล้าง 3 ครั้งด้วย PBS 5 มล. ที่มี SDS 0.2%, 3 ครั้งด้วย PBS 5 มล. ที่มียูเรีย 1 M และ 3 ครั้งด้วย PBS 5 มล.หลังจากนั้น ทริปซิน 2 ไมโครกรัมถูกเติมไปยัง 300 ไมโครลิตร 25 มิลลิโมลาร์ ABC ที่มียูเรีย 1 โมลาร์เพื่อตัดแยกโปรตีนข้ามคืนที่ 37°ซปฏิกิริยาหยุดลงโดยการเติมกรดฟอร์มิกจนกระทั่งถึง pH 2-3หลังจากทริปซิไนเซชันบนเม็ดบีด สารละลายเปปไทด์ถูกทำให้ปราศจากเกลือโดยใช้คอลัมน์ SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) และถูกทำให้แห้งในเครื่องทำให้เข้มข้นด้วยสุญญากาศ Speedvacเปปไทด์ถูกละลายซ้ำในกรดฟอร์มิก 0.1% และวิเคราะห์เปปไทด์ 500 ng โดยใช้แมสสเปกโตรมิเตอร์ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ที่ติดตั้งแหล่งกำเนิด nano-ESI ที่อธิบายไว้ข้างต้นเปปไทด์แยกจากกันบนพรีคอลัมน์ RP-HPLC เชิงพาณิชย์ (75 ไมโครเมตร x 2 ซม.) (Thermo, no. 164946) และคอลัมน์ RP-HPLC เชิงวิเคราะห์ (75 µm x 25 ซม.) (Thermo, หมายเลข 164941) ทั้งคู่เต็มไปด้วย 2 ไมโครเมตรไล่ระดับจาก 8% เป็น 35% ACN ใน 60 นาที จากนั้นเพิ่มเป็นเส้นตรงเป็น 98% B ใน 6 นาทีที่อัตราการไหล 300 Nl/นาทีMS spectra (350-1500 m/z) ถูกรวบรวมด้วยความละเอียด 60,000, AGC 4 × 105 และเวลาอินพุตสูงสุด 50 msไอออนที่เลือกถูกแยกส่วนตามลำดับโดย HCD ใน 3 รอบด้วยพลังงานการชนแบบปกติ 30% หน้าต่างการแยกสี่ส่วน 1.6 ม./z และความละเอียด 15000 แมสสเปกโตรมิเตอร์ AGC แบบตีคู่ขนาด 5 × 104 เป้าหมายและเวลาในการฉีดสูงสุด ใช้ 22 มิลลิวินาทีการยกเว้นแบบไดนามิกถูกตั้งค่าเป็น 45 วินาที ไอออนที่ไม่ได้กำหนดหรือประจุที่มีประจุ 1+ และ >7+ ถูกปฏิเสธสำหรับ MS/MS ไอออนที่ไม่ได้กำหนดหรือประจุที่มีประจุ 1+ และ >7+ ถูกปฏิเสธสำหรับ MS/MS Неназначенные ионы ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. ไอออนหรือไอออนที่ไม่ได้กำหนดที่มีประจุ 1+ และ >7+ ถูกปฏิเสธสำหรับ MS/MS未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. ไอออนหรือไอออนที่ไม่ระบุรายละเอียดที่มีประจุ 1+ และ >7+ ถูกปฏิเสธสำหรับ MS/MS
การเตรียมตัวอย่างเพิ่มขึ้นจนถึงการเพิ่มความอุดมสมบูรณ์ของเม็ดบีดนิวตร้าอะวิดินเหมือนกับในการวิเคราะห์ LC-MS/MS ที่บรรยายไว้ข้างต้นไลเซตประมาณ 50 ไมโครกรัมถูกใช้เป็นปัจจัยป้อนเข้าสำหรับการควบคุมการโหลด และใช้ไลเซต 2 มก. สำหรับปฏิกิริยาคลิกหลังจากการเสริมคุณค่าและการล้างด้วยนิวตราวิดิน โปรตีนที่ถูกจับถูกชะโดยการเพิ่มบัฟเฟอร์ของแลมลี 50 ไมโครลิตรลงในเม็ดบีดอะกาโรสเรซินและเดือดที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีอินพุตควบคุมโหลดและตัวอย่างที่เสริมด้วยเม็ดบีดถูกวิเคราะห์โดย SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF (Millipore, #ISEQ00010) โดยวิธี Western blot มาตรฐานเยื่อหุ้มถูกปิดกั้นด้วยนมพร่องมันเนย 5% (Sangon, #A600669) ใน TBS ที่มี 0.1% ทวีน -20 (TBST) และฟักไข่ตามลำดับด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิแอนติบอดีปฐมภูมิถูกเจือจาง 1:1000 ในนมพร่องมันเนย 5% ใน TBST และบ่มข้ามคืนที่ 4°Cแอนติบอดีทุติยภูมิถูกใช้ในอัตราส่วน 1:5000 และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องเยื่อหุ้มเซลล์ถูกมองเห็นโดยเคมีเรืองแสงโดยใช้ระบบภาพ Chemidoc MPการสแกนรอยเปื้อนและเจลที่ไม่ได้เจียระไนทั้งหมดในรูปจะแสดงเป็นข้อมูลดิบ
แอนติบอดีปฐมภูมิที่ใช้ในการศึกษานี้รวมถึงโมโนโคลนอลแอนติบอดีต้าน SFPQ ของกระต่าย (CST หมายเลข 71992) โมโนโคลนอลแอนติบอดีต้าน FUS ของกระต่าย (CST หมายเลข 67840) โพลีโคลนอลแอนติบอดีต้าน NSUN2 ของกระต่าย (Proteintech หมายเลข 20854-1- AP), โพลีโคลนอลแอนติบอดีต้าน mSin3A ของกระต่าย (Abcam, #ab3479), โมโนโคลนัลแอนติบอดีต้านแท็กของเมาส์ (TransGen, #HT201-02), โมโนโคลนอลแอนติบอดีต้านβ-แอคตินในหนูเมาส์ (TransGen, #HC201-01), ยาต้านกระต่าย -CDK2 มอนอโคลนอลแอนติบอดี (ABclonal, #A0094), โมโนโคลนัลแอนติบอดีของกระต่ายกับ CTBP1 (ABclonal, #A11600), โพลีโคลนัลแอนติบอดีของกระต่ายกับ DUT (ABclonal, #A2901), โพลีโคลนัลแอนติบอดีของกระต่ายกับ PSMC4 (ABclonal, #A2505), สารต้านกระต่าย- DNAJB1 โพลีโคลนอลแอนติบอดี (ABclonal, # A5504)แอนติบอดีเหล่านี้ถูกใช้ที่การเจือจาง 1:1000 ในนมพร่องมันเนย 5% ใน TBSTแอนติบอดีทุติยภูมิที่ใช้ในการศึกษานี้รวมถึง IgG ต้านกระต่าย (TransGen, #HS101-01), IgG ต้านเมาส์ (TransGen, #HS201-01) ที่การเจือจาง 1:5000
เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมว่า BRD4 โต้ตอบกับ SFPQ หรือไม่ เซลล์ HEK293T และ BRD4-miniSOG ที่เสถียรซึ่งแสดงออกมากเกินไป HEK293T ถูกชุบในจานขนาด 10 ซม.เซลล์ถูกล้างด้วย PBS ที่เย็นจัดและสลายในบัฟเฟอร์การแยกย่อย Pierce IP 1 มล. (Thermo Fisher, #87787) ด้วยตัวยับยั้งโพรทีเอสที่ปราศจาก EDTA เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4°Cหลังจากนั้น ไลเซตถูกรวบรวมในหลอดสำหรับการปั่นแยก 1.5 มล. และหมุนเหวี่ยงที่ 15,871 xg เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°ซส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเก็บเกี่ยวและบ่มด้วยมอนอโคลนอลแอนติบอดีของหนูเมาส์ที่ติดฉลากต้าน V5 5 ไมโครกรัม (CST, #80076) ค้างคืนที่ 4°Cล้างเม็ดแม่เหล็ก A/G โปรตีน A/G ประมาณ 50 ไมโครลิตร (MCE, #HY-K0202) สองครั้งด้วย PBS ที่มี 0.5% Tween-20จากนั้นเซลล์ไลเซตถูกบ่มด้วยเม็ดบีดแม่เหล็กเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 4°ซ โดยหมุนจากล่างขึ้นบนจากนั้นจึงล้างเม็ดบีดสี่ครั้งด้วยบัฟเฟอร์ PBST 1 มล. และต้มที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตัวอย่างถูกวิเคราะห์บนเจล SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF โดยใช้วิธี Western blot มาตรฐานเยื่อหุ้มเซลล์ถูกปิดกั้นในนมพร่องมันเนย 5% ใน TBST และฟักไข่ตามลำดับด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิแอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับกระต่ายต้าน SFPQ โมโนโคลนัลแอนติบอดี (CST, #71992) ถูกใช้ในอัตราส่วน 1:1000 ในนมพร่องมันเนย 5% ใน TBST และบ่มข้ามคืนที่ 4°CIgG ต้านกระต่ายถูกใช้ในอัตราส่วน 1:5000 และฟักเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องเยื่อหุ้มเซลล์ถูกมองเห็นโดยเคมีเรืองแสงโดยใช้ระบบภาพ Chemidoc MP
โครงสร้างทั้งหมดที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ Solvent Accessible Surface Area (SASA) ได้มาจาก Protein Data Bank (PDB)52 หรือฐานข้อมูลโครงสร้างโปรตีน AlphaFold 53SASA แบบสัมบูรณ์ถูกคำนวณสำหรับเรซิดิวแต่ละตัวโดยใช้โปรแกรม FreeSASAเฉพาะข้อมูล SASA ที่สมบูรณ์และชัดเจนสำหรับฮิสทิดีนที่มีป้ายกำกับและเพื่อนบ้านเท่านั้นที่ใช้เพื่อให้ได้ค่า SASA เฉลี่ยสำหรับแต่ละโครงสร้างความสามารถในการเข้าถึงตัวทำละลายสัมพัทธ์ (RSA) สำหรับฮิสทิดีนแต่ละตัวถูกคำนวณโดยการหารค่า SASA สัมบูรณ์ด้วยพื้นที่ผิวเรซิดิวสูงสุดที่เป็นไปได้ในเชิงประจักษ์ที่มีให้สำหรับตัวทำละลายจากนั้นฮิสทิดีนทั้งหมดจะถูกจัดประเภทเป็นซ่อนเร้น ถ้าค่าเฉลี่ย RSA ต่ำกว่า 20% มิฉะนั้นก็เปิดเผย56
ไฟล์ Raw ที่ได้รับในโหมด DDA ถูกค้นหาโดยใช้ Proteome Discoverer (v2.5) หรือ MSfragger (Fragpipe v15.0) ในฐานข้อมูลโปรตีน SwissProt ที่ตรวจสอบแล้วซึ่งมีสารปนเปื้อนทั่วไปเปปไทด์ต้องการทริปซินที่สมบูรณ์โดยมีตำแหน่งแตกแยกสองตำแหน่งที่ขาดหายไป คาร์บาโมอิลเมทิลเลชันเป็นการดัดแปลงแบบตายตัวและการออกซิเดชันของเมไทโอนีนเป็นการดัดแปลงแบบไดนามิกความคลาดเคลื่อนของน้ำหนักพรีเคอร์เซอร์และชิ้นส่วนถูกตั้งค่าไว้ที่ 10 ppm และ 0.02 Da (MS2 Orbitrap) ตามลำดับ การกำจัดสิ่งปนเปื้อนถูกกำจัดออกไป และโปรตีนถูกกรองเพื่อให้ได้อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด <1% การกำจัดสิ่งปนเปื้อนถูกกำจัดออกไป และโปรตีนถูกกรองเพื่อให้ได้อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด <1% Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффоциннт на белки отфильтрованы, чтобы получить коэффоциннт отфильтрованы < การกำจัดสิ่งปนเปื้อนถูกกำจัดออกและกรองโปรตีนเพื่อให้อัตราการตรวจจับที่ผิดพลาด <1%去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1% 错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных ญ. การกำจัดสิ่งปนเปื้อนถูกกำจัดออกและกรองโปรตีนเพื่อให้ได้อัตราบวกที่ผิดพลาดที่ <1%สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยไม่ใช้ฉลาก ใช้ปริมาณโปรตีนที่ทำให้เป็นมาตรฐานจากการทำซ้ำทางชีวภาพสามครั้งการวิเคราะห์การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของโปรตีนดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ยีน Ontology (GO) จาก DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 และฐานข้อมูลที่รวบรวมและเผยแพร่โดยกลุ่ม Alice Tingแผนที่ภูเขาไฟได้มาจาก Perseus (v1.6.15.0) การเปลี่ยนแปลงความสมบูรณ์ของโปรตีนถูกทดสอบสำหรับนัยสำคัญทางสถิติโดยใช้การทดสอบ t แบบสองด้าน และการพบโปรตีนถูกระบุด้วยการเปลี่ยนแปลงความอุดมสมบูรณ์ >2 (เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น) และค่า p <0.05 การเปลี่ยนแปลงความสมบูรณ์ของโปรตีนถูกทดสอบสำหรับนัยสำคัญทางสถิติโดยใช้การทดสอบ t แบบสองด้าน และการพบโปรตีนถูกระบุด้วยการเปลี่ยนแปลงความอุดมสมบูรณ์ >2 (เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น) และค่า p <0.05 Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. การเปลี่ยนแปลงการพับของปริมาณโปรตีนได้รับการทดสอบสำหรับนัยสำคัญทางสถิติโดยใช้การทดสอบแบบสองด้าน และการจับคู่โปรตีนถูกระบุด้วยการเปลี่ยนแปลงเนื้อหา >2 (เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น) และค่า ap <0.05使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中的丰度变化> 2（除非另有说明）和p 值<0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. นัยสำคัญทางสถิติของการเปลี่ยนแปลงเท่าของปริมาณโปรตีนได้รับการทดสอบโดยใช้ t-test แบบสองด้าน และหาการจับคู่ของโปรตีนสำหรับการเปลี่ยนแปลงเนื้อหา >2 (เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น) และค่า p <0.05การวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ GO ร่วมกับฐานข้อมูลสตริง
ทำซ้ำทางชีวภาพสามครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันวิเคราะห์ทางสถิติด้วย GraphPad Prism (ซอฟต์แวร์ GraphPad) และสร้างแผนภาพภูเขาไฟด้วย Perseus (v1.6.15.0)ในการเปรียบเทียบทั้งสองกลุ่ม ค่า p ถูกกำหนดโดยใช้แบบทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้านมีเพียงโปรตีนซิงเกิลตันที่ระบุอย่างน้อยสองครั้งในกลุ่มทดลองเท่านั้นที่รวมอยู่ในแปลงภูเขาไฟและค่าที่หายไปที่สอดคล้องกันในกลุ่มควบคุมถูกแทนที่ด้วย Perseus จากการแจกแจงแบบปกติเพื่อให้สามารถคำนวณค่า p ได้แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานในการวิเคราะห์โปรตีโอมิกสำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ ความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนที่ปรากฏในการจำลองแบบทางชีวภาพอย่างน้อยสองครั้งยังคงไว้ไม่ได้ใช้วิธีการทางสถิติในการกำหนดขนาดตัวอย่างล่วงหน้าการทดลองไม่ได้สุ่มนักวิจัยไม่ได้ปิดบังงานระหว่างการทดลองและประเมินผล
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา ดูบทคัดย่อรายงานการวิจัยธรรมชาติที่เชื่อมโยงกับบทความนี้
ข้อมูลแมสสเปกโตรเมตรีที่ได้รับในการศึกษานี้ถูกส่งไปยัง ProteomeXchange Consortium ผ่านที่เก็บของคู่ค้า iProX57 ภายใต้ชุดข้อมูล ID PXD034811 (ชุดข้อมูล PDPL-MS)ข้อมูลดิบมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลดิบบทความนี้ให้ข้อมูลต้นฉบับ
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ทำความรู้จักกับพื้นที่ใกล้เคียง: การใช้ไบโอตินิเลชั่นที่ขึ้นกับความใกล้ชิดเพื่อกำหนดลักษณะโปรตีนเชิงซ้อนและออร์แกเนลล์แผนที่ Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ทำความรู้จักกับพื้นที่ใกล้เคียง: การใช้ไบโอตินิเลชั่นที่ขึ้นกับความใกล้ชิดเพื่อกำหนดลักษณะโปรตีนเชิงซ้อนและออร์แกเนลล์แผนที่Gingras, AS, Abe, KT และ Raut, B. ความคุ้นเคยกับสภาพแวดล้อม: การใช้ biotinylation ที่ขึ้นกับความใกล้ชิดเพื่อกำหนดลักษณะโปรตีนเชิงซ้อนและออร์แกเนลล์แผนที่ Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. รูปภาพ： Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ทำความเข้าใจกับพื้นที่ใกล้เคียง: ใช้การพึ่งพาอาศัยของเพื่อนบ้านในสิ่งมีชีวิตทางชีววิทยาGingras, AS, Abe, KT และ Raut, B. การทำความเข้าใจความใกล้ชิด: การกำหนดลักษณะของโปรตีนเชิงซ้อนและการทำแผนที่ของออร์แกเนลล์โดยใช้ไบโอตินิเลชั่นที่ขึ้นกับความใกล้ชิดหมุนเวียน.ความคิดเห็นของฉัน.เคมี.ชีววิทยา 48, 44–54 (2019).
เจอรี่ เจบี และคณะการทำแผนที่สภาพแวดล้อมจุลภาคโดยการถ่ายโอนพลังงาน Dexter ไปยังเซลล์ภูมิคุ้มกันวิทยาศาสตร์ 367, 1091–1097 (2020)
Hertling, EL และคณะเครือข่ายมาตราส่วนสองโปรตีนจะตรวจจับการเปลี่ยนแปลงเฉพาะเซลล์ของปฏิสัมพันธ์ของมนุษย์เซลล์ 184, 3022–3040.e3028 (2021)