ข่าว

กลยุทธ์การวินิจฉัยแบบดั้งเดิมสำหรับการตรวจหาโรคติดเชื้อต้องใช้เครื่องมือตั้งโต๊ะที่ไม่เหมาะสำหรับการทดสอบ ณ จุดดูแล (POCT)ไมโครฟลูอิดิกส์ที่กำลังเกิดขึ้นใหม่เป็นเทคโนโลยีที่มีการย่อขนาดสูง เป็นอัตโนมัติและผสานรวม ซึ่งเป็นทางเลือกที่เป็นไปได้สำหรับวิธีการแบบเดิมสำหรับการวินิจฉัยในสถานที่ทำงานที่รวดเร็ว ต้นทุนต่ำ และแม่นยำวิธีการวินิจฉัยระดับโมเลกุลใช้กันอย่างแพร่หลายในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกซึ่งเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพที่สุดในการตรวจหาเชื้อโรคการทบทวนนี้สรุปความก้าวหน้าล่าสุดในการวินิจฉัยระดับโมเลกุลของโรคติดเชื้อโดยใช้ไมโครฟลูอิดิกจากมุมมองทางวิชาการและทางอุตสาหกรรมอันดับแรก เราอธิบายการประมวลผลกรดนิวคลีอิกแบบปกติบนชิป รวมถึงการปรับสภาพตัวอย่าง การขยายเสียง และการอ่านสัญญาณจากนั้นเปรียบเทียบลักษณะ ข้อดี และข้อเสียของแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกสี่ประเภทต่อไป เราจะหารือเกี่ยวกับการใช้ชุดตรวจดิจิทัลสำหรับการหาปริมาณกรดนิวคลีอิกแบบสัมบูรณ์อุปกรณ์ตรวจวินิจฉัยระดับโมเลกุลที่ใช้ไมโครฟลูอิดิกเชิงพาณิชย์ทั้งแบบคลาสสิกและแบบล่าสุดนั้นได้สรุปไว้เป็นหลักฐานของสถานะปัจจุบันของตลาดสุดท้ายนี้ เราขอเสนอทิศทางในอนาคตสำหรับการวินิจฉัยโรคติดเชื้อไมโครฟลูอิดิกในอนาคต
โรคติดเชื้อเกิดจากเชื้อโรค รวมทั้งแบคทีเรีย ไวรัส และปรสิตที่กระจายไปทั่วโลกซึ่งแตกต่างจากโรคอื่นๆ เชื้อโรคจะติดเชื้อและแพร่กระจายอย่างรวดเร็วระหว่างมนุษย์และสัตว์ที่เป็นที่อยู่อาศัยผ่านการเพาะเชื้อ อากาศ และน้ำ [1]การป้องกันโรคติดเชื้อมีความสำคัญในฐานะมาตรการด้านสาธารณสุขสามกลยุทธ์หลักในการต่อสู้กับโรคติดเชื้อ: (1) ควบคุมแหล่งที่มาของการติดเชื้อ;(2) การหยุดชะงักของเส้นทางส่งสัญญาณ(3) การคุ้มครองประชากรที่อ่อนแอในบรรดากลยุทธ์หลัก การควบคุมแหล่งที่มาของการติดเชื้อถือเป็นกลยุทธ์ที่สำคัญที่สุดเนื่องจากความสะดวกและต้นทุนต่ำการวินิจฉัย การแยกตัว และการรักษาผู้ติดเชื้ออย่างรวดเร็วมีความสำคัญ ซึ่งต้องใช้กลยุทธ์การวินิจฉัยที่รวดเร็ว ละเอียดอ่อน และแม่นยำ [2]การวินิจฉัยโรคติดเชื้อในปัจจุบันมักจะรวมการตรวจทางคลินิกโดยพิจารณาจากสัญญาณและอาการ และการศึกษาในห้องปฏิบัติการ เช่น การเพาะเลี้ยงเซลล์และการวินิจฉัยระดับโมเลกุล ซึ่งต้องใช้บุคลากรที่ได้รับการฝึกอบรม ขั้นตอนการใช้แรงงานมาก และอุปกรณ์ทดสอบราคาแพง [3, 4]การป้องกันการระบาดของโรคติดเชื้อต้องการการวินิจฉัยในท้องถิ่นที่รวดเร็ว ราคาไม่แพง และแม่นยำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในพื้นที่จำกัดทรัพยากรซึ่งมีโรคติดต่อทั่วไปและรุนแรง [5] เช่นเดียวกับการรักษาในถิ่นทุรกันดารหรือในสนามรบ ซึ่งเหตุฉุกเฉินไม่อาจคาดเดาได้.การรักษาพยาบาลมีจำกัด [6].ในบริบทนี้ ไมโครฟลูอิดิกส์เป็นเทคโนโลยีที่รวมเทคโนโลยีระบบเครื่องกลไฟฟ้าขนาดเล็ก นาโนเทคโนโลยี หรือวิทยาศาสตร์วัสดุเพื่อการจัดการของเหลวที่แม่นยำ [7,8,9,10] ทำให้เกิดความเป็นไปได้ใหม่ๆ สำหรับการตรวจจับ ณ จุดดูแล (POCT)) สารติดเชื้อนอกโรงพยาบาลและห้องปฏิบัติการเมื่อเทียบกับการวินิจฉัยแบบเดิมๆ ที่ใช้เวลานาน เทคโนโลยีไมโครฟลูอิดิกให้ตัวอย่างและประหยัดค่าใช้จ่ายสำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลระหว่างการระบาดของโรคการแพร่กระจายของโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (COVID-19) ทั่วโลก เกิดจากโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ดังนั้นจึงเน้นย้ำถึงความสำคัญของไมโครฟลูอิดิกส์ในการป้องกันและควบคุมโรคระบาดอย่างทันท่วงที [11, 12] , 13].ไมโครฟลูอิดิก POCT ต่างจากการวินิจฉัยแบบดั้งเดิม ใช้อุปกรณ์พกพาขนาดเล็กตั้งแต่เครื่องวิเคราะห์แบบตั้งโต๊ะไปจนถึงแถบทดสอบไซด์สตรีมขนาดเล็กเพื่อทดสอบใกล้กับจุดสุ่มตัวอย่าง [14]การทดสอบเหล่านี้ประกอบด้วยการเตรียมตัวอย่างที่ง่ายหรือไม่มีเลย การขยายสัญญาณอย่างรวดเร็ว และการอ่านสัญญาณที่มีความละเอียดอ่อน ส่งผลให้ระยะเวลาสั้นและผลลัพธ์ที่แม่นยำภายในไม่กี่นาทีความพร้อมใช้งานและการผลิตจำนวนมากของเครื่องมือดูแลสุขภาพที่ใช้ไมโครฟลูอิดิกได้ขยายการใช้งานการวินิจฉัยโดยตรงที่คุ้มค่าและตรงนอกโรงพยาบาล ใกล้ผู้ป่วย และแม้แต่ที่บ้าน
ในบรรดากลยุทธ์ที่มีอยู่สำหรับการวินิจฉัยโรคติดเชื้อ การวินิจฉัยระดับโมเลกุลเป็นหนึ่งในกลยุทธ์ที่ละเอียดอ่อนที่สุด [15, 16]นอกจากนี้ การวินิจฉัยระดับโมเลกุลมักถูกใช้เป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการตรวจหาเชื้อโควิด-19 อย่างต่อเนื่อง ทำให้สามารถตรวจหาบริเวณ RNA หรือ DNA เฉพาะของไวรัสได้โดยตรงก่อนที่จะเริ่มมีการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน [17, 18]ในการทบทวนปัจจุบัน เรานำเสนอความก้าวหน้าล่าสุดในกระบวนการวินิจฉัยระดับโมเลกุลที่ใช้ไมโครฟลูอิดิกส์สำหรับโรคติดเชื้อ จากมุมมองทางวิชาการไปจนถึงมุมมองของอุตสาหกรรมในอนาคต (รูปที่ 1)เราจะเริ่มต้นด้วยสามขั้นตอนสำคัญในการตรวจหากรดนิวคลีอิก: การปรับสภาพตัวอย่างบนชิป การขยายกรดนิวคลีอิก และการอ่านสัญญาณจากนั้น เราเปรียบเทียบแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกประเภทต่างๆ กับโครงสร้างและหน้าที่ โดยแสดงลักษณะเฉพาะ (จุดแข็งและจุดอ่อน)การตรวจหากรดนิวคลีอิกแบบดิจิทัลยังถูกกล่าวถึงเพิ่มเติมและให้เป็นตัวอย่างของเทคโนโลยีรุ่นที่สามสำหรับการหาปริมาณที่แน่นอนของโมเลกุลของเชื้อโรคที่ติดเชื้อนอกจากนี้ จะมีการนำเสนออุปกรณ์ POCT เชิงพาณิชย์ทั่วไปและล่าสุดจำนวนมากเพื่อแสดงสถานะปัจจุบันของตลาด POCT ไมโครฟลูอิดิกสำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลเราจะหารือและอธิบายวิสัยทัศน์ของเราสำหรับการใช้งานในอนาคตด้วย
โมดูลของไมโครฟลูอิดิกชิปสำหรับการตรวจจับกรดนิวคลีอิกสามารถแบ่งออกเป็นสามประเภท (การสุ่มตัวอย่าง การจดจำ และการส่งสัญญาณ) ตามหน้าที่ [19]ในบรรดาโมดูลเหล่านี้ โมดูลสุ่มตัวอย่างจะทำการแยกตัวอย่างและการสกัดกรดนิวคลีอิกเป็นส่วนใหญ่โมดูลเซ็นเซอร์ควบคุมการแปลงและขยายสัญญาณกรดนิวคลีอิกเป็นหลักโมดูลสัญญาณตรวจจับสัญญาณที่แปลงและประมวลผลโดยโมดูลตรวจจับจากกระบวนการตรวจจับกรดนิวคลีอิกบนชิป เราจะสรุปชิปต่างๆ ที่สามารถรับรู้ฟังก์ชัน "อินพุตและเอาต์พุต"
ขั้นตอนแรกในการตรวจหากรดนิวคลีอิกคือการสกัดกรดนิวคลีอิก กล่าวคือ แยกกรดนิวคลีอิกเป้าหมายออกจากตัวอย่างเดิมการสกัดกรดนิวคลีอิกจะดำเนินการเพื่อทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์จากสารปนเปื้อนระดับโมเลกุลอื่นๆ ทำให้เกิดความมั่นใจในความสมบูรณ์ของโครงสร้างหลักของโมเลกุลกรดนิวคลีอิก และผลลัพธ์ที่เหมาะสมที่สุดการสกัดกรดนิวคลีอิกจำเป็นต้องมีการแยกตัวอย่างและการจับกรดนิวคลีอิกที่จำเป็น ซึ่งคุณภาพและประสิทธิภาพมีผลกระทบอย่างมากต่อผลการวิจัยและการวินิจฉัยผลข้างเคียงเล็กน้อยในระหว่างการสกัดอาจจำกัดการตรวจจับเพิ่มเติมตัวอย่างเช่น ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) และวิธีการขยายไอโซเทอร์มอลแบบลูป (LAMP) ถูกยับยั้งโดยตัวทำละลายอินทรีย์ที่เหลือบางตัว เช่น เอทานอลและไอโซโพรพานอลในรีเอเจนต์การแยกกรดนิวคลีอิก [20]การสกัดของเหลวและของเหลวและการสกัดด้วยเฟสของแข็งเป็นวิธีที่ได้รับความนิยมมากที่สุดสำหรับการแยกกรดนิวคลีอิก [21] อย่างไรก็ตาม การสกัดของเหลวและของเหลวบนชิปมีข้อ จำกัด อย่างมาก เนื่องจากรีเอเจนต์ที่ใช้ในการสกัดของเหลวและของเหลวทำให้เกิดการกัดกร่อนของชิปไมโครฟลูอิดิกส่วนใหญ่ .ในที่นี้ เราเน้นย้ำถึงวิธีการสกัดแบบโซลิดเฟสแบบไมโครอาร์เรย์ และเปรียบเทียบข้อดีและข้อเสีย
ซิลิคอนเป็นวัสดุตั้งต้นที่เข้ากันได้กับกรดนิวคลีอิกเนื่องจากความเข้ากันได้ทางชีวภาพ ความเสถียร และความง่ายในการดัดแปลง [22]ที่สำคัญเมื่อดัดแปลงด้วยซิลิกาหรือวัสดุอื่นๆ คอมโพสิตนี้แสดงคุณสมบัติในการดูดซับกรดนิวคลีอิกที่มีประจุลบภายใต้ pH ต่ำ สภาพเกลือสูงในขณะที่ชะด้วย pH สูง สารละลายเกลือต่ำจากปรากฏการณ์นี้ เป็นไปได้ที่จะทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์
มีการใช้วัสดุที่มีซิลิกาในรูปแบบต่างๆ สำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิกในไมโครฟลูอิดิกส์ เช่น เม็ดซิลิกา ผง ตัวกรองไมโครไฟเบอร์ และเยื่อซิลิกา [23, 24, 25, 26]ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของวัสดุ วัสดุที่ใช้ซิลิกอนสามารถนำมาใช้ในไมโครเซอร์กิตได้หลายวิธีตัวอย่างเช่น เม็ดซิลิกา ผง และนาโนฟิลเตอร์เชิงพาณิชย์สามารถวางลงในรูพรุนหรือช่องไมโครของชิปไมโครฟลูอิดิก และช่วยแยกกรดนิวคลีอิกออกจากตัวอย่าง [27, 28, 29]เยื่อซิลิกาดัดแปลงพื้นผิวยังสามารถนำมาใช้เพื่อทำให้ DNA บริสุทธิ์จากเชื้อโรคได้อย่างรวดเร็วด้วยต้นทุนต่ำตัวอย่างเช่น Wang และคณะ[30] โดยการรวมปฏิกิริยาการขยายการทำให้เสียสภาพกับการแลกเปลี่ยนลูกโซ่ที่อาศัยถุงน้ำกับเยื่อหุ้มซิลิกาที่เคลือบด้วยไคโตซานโอลิโกแซ็กคาไรด์ ได้มีการแนะนำระบบพกพาอเนกประสงค์ที่ตรวจพบหน่วยการสร้างอาณานิคมได้สำเร็จ 102–108(CFU)/มล. Vibrio parahaemolyticusและการปรากฏตัวของไวรัสก็มองเห็นได้ง่ายพาวเวลล์และคณะ[31] จากนั้นจึงใช้ไมโครอาร์เรย์แบบซิลิคอนเพื่อตรวจหาไวรัสตับอักเสบซี (HCV) ไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ (HIV) ไวรัสซิก้า และไวรัส human papillomavirus และการแพร่กระจายโดยอัตโนมัติ ซึ่งได้มีการพัฒนาไมโครรีแอคเตอร์แบบคดเคี้ยวขนาด 1.3 ไมโครลิตรเพื่อดักจับไวรัสอาร์เอ็นเอและดำเนินการขยายสัญญาณในแหล่งกำเนิดนอกจากวิธีการเหล่านี้แล้ว ไมโครคอลัมน์ซิลิกาดัดแปลงพื้นผิวยังมีบทบาทสำคัญในการสกัดกรดนิวคลีอิก เนื่องจากรูปทรงและคุณสมบัติของวัสดุดัดแปลงช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการสกัดอย่างมากเฉินและคณะ[32] เสนอแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกสำหรับการแยกอาร์เอ็นเอที่มีความเข้มข้นต่ำโดยอิงจากไมโครคอลัมน์ซิลิกอนเคลือบอะมิโนอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกนี้รวมอาร์เรย์ของเสาขนาดเล็ก 0.25 ซม.2 ไว้บนพื้นผิวซิลิกอนเพื่อให้ได้ประสิทธิภาพการสกัดที่สูงขึ้นผ่านการออกแบบอัตราส่วนพื้นที่ผิวต่อปริมาตรสูงข้อดีของการออกแบบนี้คืออุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกสามารถบรรลุประสิทธิภาพการสกัดกรดนิวคลีอิกสูงถึง 95%กลยุทธ์ที่ใช้ซิลิกอนเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงคุณค่าของการแยกกรดนิวคลีอิกอย่างรวดเร็วด้วยต้นทุนที่ต่ำเมื่อใช้ร่วมกับชิปไมโครฟลูอิดิก กลยุทธ์การสกัดด้วยซิลิกอนไม่เพียงแต่เพิ่มประสิทธิภาพในการตรวจจับกรดนิวคลีอิกเท่านั้น แต่ยังช่วยอำนวยความสะดวกในการย่อขนาดและการรวมอุปกรณ์วิเคราะห์ [20]
วิธีการแยกด้วยแม่เหล็กใช้อนุภาคแม่เหล็กเพื่อแยกกรดนิวคลีอิกเมื่อมีสนามแม่เหล็กภายนอกอนุภาคแม่เหล็กที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ อนุภาคแม่เหล็ก Fe3O4 หรือ γ-Fe2O3 ที่เคลือบด้วยซิลิกา อะมิโน และคาร์บอกซิล [33,34,35,36]คุณลักษณะที่แตกต่างของอนุภาคแม่เหล็กเมื่อเปรียบเทียบกับวิธี SPE ที่ใช้ซิลิกอนคือความสะดวกในการจัดการและควบคุมด้วยแม่เหล็กภายนอก
การใช้ปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิตระหว่างกรดนิวคลีอิกและซิลิกาภายใต้สภาวะที่มีเกลือสูงและ pH ต่ำ กรดนิวคลีอิกจะถูกดูดซับบนพื้นผิวของอนุภาคแม่เหล็กที่เคลือบซิลิกา ในขณะที่ภายใต้สภาวะของเกลือต่ำและ pH สูง โมเลกุลสามารถล้างได้ อีกครั้ง..เม็ดบีดแม่เหล็กเคลือบซิลิกาทำให้สามารถแยก DNA จากตัวอย่างปริมาณมาก (400 ไมโครลิตร) โดยใช้การเคลื่อนที่ที่ควบคุมด้วยแม่เหล็กได้ [37]ในการสาธิต Rodriguez-Mateos และคณะ[38] ใช้แม่เหล็กที่ปรับได้เพื่อควบคุมการถ่ายโอนเม็ดแม่เหล็กไปยังห้องต่างๆจากอนุภาคแม่เหล็กที่เคลือบซิลิกา สามารถสกัด 470 ชุด/มล. ของจีโนมอาร์เอ็นเอ SARS-CoV-2 จากตัวอย่างน้ำเสียสำหรับการตรวจจับการถอดรหัสย้อนกลับของ LAMP (RT-LAMP) และสามารถอ่านการตอบสนองได้ภายใน 1 ชั่วโมงตาเปล่า (รูปที่ 2a)
อุปกรณ์ที่ใช้วัสดุที่เป็นแม่เหล็กและมีรูพรุนแผนภาพแนวคิดของอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิก IFAST RT-LAMP สำหรับการตรวจจับอาร์เอ็นเอ SARS-CoV-2 (ดัดแปลงจาก [38])b อุปกรณ์ไมโครแรงเหวี่ยงสำหรับ dSPE ของกรดนิวคลีอิกของไม้กวาดแก้ม (ดัดแปลงจาก [39])c หัวจ่ายตัวอย่างแบบขับเคลื่อนด้วยตัวเองในตัวโดยใช้การ์ด FTA® (ดัดแปลงมาจาก [50])d กระดาษกรอง Fusion 5 ดัดแปลงด้วยไคโตซาน (ดัดแปลงจาก [51])SARS-CoV-2 โรคระบบทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง coronavirus 2, RT-LAMP การขยายสัญญาณไอโซเทอร์มอลแบบย้อนกลับ RT-LAMP, พันธมิตรเทคโนโลยีค้นหา FTA, กรดนิวคลีอิก NA
อนุภาคแม่เหล็กที่มีประจุบวกเหมาะสำหรับการติดกระดูกสันหลังฟอสเฟตของกรดนิวคลีอิกที่ความเข้มข้นของเกลือในระดับหนึ่ง กลุ่มฟอสเฟตที่มีประจุลบของกรดนิวคลีอิกสามารถมีประจุบวกบนพื้นผิวของอนุภาคคอมโพสิตแม่เหล็กดังนั้นอนุภาคนาโนแม่เหล็กที่มีพื้นผิวขรุขระและกลุ่มอะมิโนที่มีความหนาแน่นสูงจึงได้รับการพัฒนาสำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิกหลังจากการแยกและการปิดกั้นด้วยแม่เหล็ก อนุภาคนาโนแม่เหล็กและสารเชิงซ้อนของดีเอ็นเอสามารถนำมาใช้โดยตรงใน PCR ซึ่งช่วยลดความจำเป็นในการทำให้บริสุทธิ์และชะล้างที่ซับซ้อนและใช้เวลานาน [35]อนุภาคนาโนแม่เหล็กที่เคลือบด้วยกลุ่มคาร์บอกซิลเชิงลบยังถูกใช้เพื่อแยกกรดนิวคลีอิกที่ดูดซับบนพื้นผิวในสารละลายโพลีเอทิลีนไกลคอลและโซเดียมคลอไรด์ที่มีความเข้มข้นสูงด้วยเม็ดแม่เหล็กที่ปรับเปลี่ยนพื้นผิวเหล่านี้ การสกัด DNA จึงเข้ากันได้กับการขยายสัญญาณที่ตามมาDignan และคณะ[39] อธิบายเกี่ยวกับแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกแบบแรงเหวี่ยงอัตโนมัติและแบบพกพาสำหรับการปรับสภาพกรดนิวคลีอิก ซึ่งช่วยให้บุคลากรที่ไม่ใช่ด้านเทคนิคสามารถใช้งานได้ที่ไซต์งานนอกจากนี้ ความเข้ากันได้ของ DNA ที่แยกได้กับ LAMP ซึ่งเป็นวิธีการที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก ณ จุดดูแล แสดงให้เห็นเพิ่มเติมถึงข้อกำหนดของอุปกรณ์และความเหมาะสมสำหรับการทดสอบด้วยสี (รูปที่ 2b)
วิธีลูกปัดแม่เหล็กมีความเป็นไปได้ของการสกัดอัตโนมัติ ซึ่งบางส่วนมีอยู่ในเครื่องแยกกรดนิวคลีอิกอัตโนมัติเชิงพาณิชย์ [KingFisher;เทอร์โมฟิชเชอร์ (วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา), QIAcube® HT;CapitalBio (ปักกิ่ง ประเทศจีน) และ Biomek®;เบ็คแมน (ไมอามี สหรัฐอเมริกา).) ฟลอริดา สหรัฐอเมริกา)].ข้อดีของการรวมเม็ดบีดแม่เหล็กกับไมโครฟลูอิดิกส์สามารถใช้สำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิกแบบอัตโนมัติอย่างมีประสิทธิภาพ ซึ่งอาจนำไปสู่การพัฒนาการวินิจฉัยระดับโมเลกุลอย่างไรก็ตาม การผสมผสานระหว่างเม็ดบีดแม่เหล็กกับไมโครฟลูอิดิกส์ยังคงอาศัยระบบควบคุมที่ซับซ้อนเพื่อการจัดการเม็ดบีดแม่เหล็กได้อย่างแม่นยำ ซึ่งอธิบายความนิยมของผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์ที่มีขนาดใหญ่และมีราคาแพง ซึ่งจำกัดการใช้เม็ดลูกปัดแม่เหล็กเพิ่มเติมใน POCT
วัสดุที่มีรูพรุนหลายชนิด เช่น ตัวกรองไนโตรเซลลูโลสดัดแปลง การ์ด Finders Technology Associates (FTA) กระดาษกรองแบบโพลีอีเทอร์ซัลโฟน และวัสดุที่เคลือบด้วยไกลแคนยังถูกนำมาใช้สำหรับการตรวจจับกรดนิวคลีอิก [40, 41, 42, 43, 44]วัสดุเส้นใยที่มีรูพรุน เช่น กระดาษเส้นใย ถูกใช้ครั้งแรกเพื่อแยก DNA โดยการพันกันทางกายภาพของโมเลกุล DNA ที่มีเส้นยาวด้วยเส้นใยรูพรุนขนาดเล็กทำให้เกิดการจำกัดทางกายภาพของโมเลกุลดีเอ็นเอ ซึ่งส่งผลดีต่อการสกัดดีเอ็นเอเนื่องจากขนาดรูพรุนของกระดาษเส้นใยต่างกัน ประสิทธิภาพในการสกัดจึงไม่สามารถตอบสนองความต้องการของการขยาย DNA [45, 46]บัตร FTA เป็นกระดาษกรองเชิงพาณิชย์ที่ใช้ในด้านนิติเวชศาสตร์ และใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านอื่นๆ ของการวินิจฉัยระดับโมเลกุลด้วยการใช้กระดาษกรองเซลลูโลสที่ชุบด้วยสารเคมีต่างๆ เพื่อสลายเยื่อหุ้มเซลล์ในตัวอย่าง DNA ที่ปล่อยออกมาจะได้รับการปกป้องจากการย่อยสลายนานถึง 2 ปีไม่นานมานี้ กระดาษเซลลูโลสที่ชุบได้ได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจหาระดับโมเลกุลของเชื้อโรคต่างๆ รวมถึง SARS-CoV-2, leishmaniasis และมาลาเรีย [47,48,49]เชื้อเอชไอวีในพลาสมาที่แยกได้จะถูกแยกออกโดยตรง และกรดนิวคลีอิกของไวรัสได้รับการเสริมสมรรถนะในเมมเบรนการไหลของ FTA® ที่สร้างไว้ในคอนเดนเซอร์ ซึ่งช่วยให้สามารถผลิตกรดนิวคลีอิกได้อย่างมีประสิทธิภาพ [50] (รูปที่ 2c)ปัญหาหลักในการตรวจหากรดนิวคลีอิกโดยใช้บัตร FTA คือสารเคมีเช่น guanidine และ isopropanol ยับยั้งปฏิกิริยาการขยายสัญญาณที่ตามมาเพื่อแก้ปัญหานี้ เราได้พัฒนากระดาษกรองที่ดัดแปลงด้วยไคโตซาน Fusion 5 ซึ่งรวมข้อดีของทั้งการสอดประสานทางกายภาพของโมเลกุลดีเอ็นเอและกระดาษกรองแบบเส้นใย และการดูดซับไฟฟ้าสถิตของ DNA บนสารประกอบที่ดัดแปลงด้วยไคโตซานเพื่อให้ได้การสกัดกรดนิวคลีอิกที่มีประสิทธิภาพสูง ..เส้นใยกรอง [51] (รูปที่ 2d)ในทำนองเดียวกัน Zhu และคณะ[52] สาธิตวิธี PCR ที่ดัดแปลงด้วยไคโตซานโดยใช้ระบบไมโครฟลูอิดิกในแหล่งกำเนิดเพื่อการแยกและการตรวจหาไวรัสซิก้า RNA อย่างรวดเร็วกรดนิวคลีอิกสามารถดูดซับ/ดูดซับในตัวกลางไลเสต/PCR ผสม ตามลำดับ โดยยึดตามคุณสมบัติของสวิตช์เปิด/ปิดของไคโตซานเปิดและปิด” ตอบสนองต่อ pH
ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น กลยุทธ์เหล่านี้รวมข้อดีของวัสดุที่เป็นสถานะของแข็งต่างๆ และเพิ่มประสิทธิภาพของการสกัดกรดนิวคลีอิกในไมโครฟลูอิดิกส์ในการใช้งานจริง การใช้วัสดุเหล่านี้ในปริมาณมากจะไม่ประหยัด และการรักษาพื้นผิวที่เหมาะสมหรือการปรับเปลี่ยนพื้นผิวของวัสดุทั่วไปด้วยวัสดุเหล่านี้ยังสามารถรักษาหน้าที่ของวัสดุเหล่านั้นได้ดังนั้นจึงเชื่อว่าการดำเนินการตามกลยุทธ์เหล่านี้หลังการศึกษานำร่องสามารถลดต้นทุนได้
การทดสอบกรดนิวคลีอิกบนแท่นไมโครฟลูอิดิกมักใช้ปริมาตรตัวอย่างขนาดเล็ก (< 100 ไมโครลิตร) ดังนั้นจึงต้องมีการขยายกรดนิวคลีอิกเป้าหมายด้วยหัววัดเฉพาะสำหรับการแปลงเป็นสัญญาณที่สะดวกสำหรับการตรวจจับปลายทาง (ออปติคัล ไฟฟ้า และแม่เหล็ก) [53, 54]. การทดสอบกรดนิวคลีอิกบนแท่นไมโครฟลูอิดิกมักใช้ปริมาตรตัวอย่างขนาดเล็ก (< 100 ไมโครลิตร) ดังนั้นจึงต้องมีการขยายกรดนิวคลีอิกเป้าหมายด้วยหัววัดเฉพาะสำหรับการแปลงเป็นสัญญาณที่สะดวกสำหรับการตรวจจับปลายทาง (ออปติคัล ไฟฟ้า และแม่เหล็ก) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. เมื่อทำการทดสอบกรดนิวคลีอิกบนแท่นไมโครฟลูอิดิก มักใช้ปริมาตรตัวอย่างขนาดเล็ก (<100 ไมโครลิตร) ดังนั้นจึงจำเป็นต้องขยายกรดนิวคลีอิกเป้าหมายด้วยหัววัดพิเศษเพื่อแปลงเป็นสัญญาณที่สะดวกสำหรับการตรวจจับในภายหลัง (ออปติคัล ไฟฟ้า และแม่เหล็ก) [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 ไมโครลิตร），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. การตรวจหากรดนิวคลีอิกบนแท่นไมโครฟลูอิดิกมักใช้ปริมาตรตัวอย่างขนาดเล็ก (<100 ไมโครลิตร) ซึ่งต้องการการขยายกรดนิวคลีอิกเป้าหมายด้วยหัววัดพิเศษเพื่อแปลงเป็นสัญญาณสำหรับการตรวจจับในภายหลัง (ออปติคัล ไฟฟ้า และแม่เหล็ก) [53, 54]] .การขยายกรดนิวคลีอิกในไมโครฟลูอิดิกส์ยังสามารถเร่งปฏิกิริยา เพิ่มประสิทธิภาพขีดจำกัดการตรวจจับ ลดความต้องการตัวอย่าง และปรับปรุงความแม่นยำในการตรวจจับ [55, 56]ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ด้วยการตรวจจับที่รวดเร็วและแม่นยำ วิธีการขยายกรดนิวคลีอิกต่าง ๆ ได้ถูกนำมาใช้ในไมโครฟลูอิดิกส์ รวมถึง PCR และปฏิกิริยาการขยายไอโซเทอร์มอลบางส่วนส่วนนี้จะสรุปวิธีการตรวจหากรดนิวคลีอิกตามระบบไมโครฟลูอิดิก
PCR เป็นการจำลองกระบวนการจำลอง DNA ของสิ่งมีชีวิต ซึ่งทฤษฎีนี้จะอธิบายรายละเอียดในที่อื่นๆ และจะไม่ถูกกล่าวถึงในที่นี้PCR สามารถขยาย DNA/RNA เป้าหมายจำนวนเล็กน้อยได้ในอัตราเลขชี้กำลัง ทำให้ PCR เป็นเครื่องมือที่ทรงพลังสำหรับการตรวจหากรดนิวคลีอิกอย่างรวดเร็วในทศวรรษที่ผ่านมา อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกแบบพกพาจำนวนมากที่ติดตั้งระบบหมุนเวียนความร้อนด้วย PCR ได้รับการพัฒนาเพื่อตอบสนองความต้องการของการวินิจฉัย ณ จุดดูแล [57, 58]PCR บนชิปสามารถแบ่งออกได้เป็น 4 ประเภท (แบบธรรมดา, แบบไหลต่อเนื่อง, แบบสลับเชิงพื้นที่ และแบบหมุนเวียน PCR) ตามวิธีการควบคุมอุณหภูมิที่แตกต่างกัน [59]ตัวอย่างเช่น Gee และคณะ[60] พัฒนาวิธีการถอดรหัส PCR เชิงปริมาณโดยตรง (RT-qPCR) บนแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกของตนเองสำหรับการตรวจหา SARS-CoV-2 แบบทวีคูณ ไวรัสไข้หวัดใหญ่ A และ B ในตัวอย่างไม้กวาดคอ (รูปที่ 3a)ปาร์คและคณะ[61] สร้างชิปวิเคราะห์เชื้อโรคอย่างง่ายโดยการรวม PCR ฟิล์มบาง อิเล็กโทรด และโมดูลไมโครฟลูอิดิกที่ใช้โพลีไดเมทิลไซลอกเซนแบบใช้นิ้วอย่างไรก็ตาม งานทั้งสองนี้แสดงถึงข้อบกพร่องทั่วไปของ PCR แบบเดิมPCR ต้องการการหมุนเวียนความร้อน ซึ่งจำกัดการย่อขนาดอุปกรณ์เพิ่มเติม และลดเวลาในการทดสอบ
การพัฒนา PCR microfluidic และ space-switched แบบไหลต่อเนื่องเป็นสิ่งสำคัญในการแก้ไขปัญหานี้การใช้ช่องทางคดเคี้ยวยาวหรือช่องทางตรงสั้น PCR การไหลต่อเนื่องสามารถให้การขยายอย่างรวดเร็วโดยการหมุนเวียนสารทำปฏิกิริยาอย่างแข็งขันในโซนอุ่นสามโซนด้วยปั๊มนอกชิปการดำเนินการนี้ประสบความสำเร็จในการหลีกเลี่ยงช่วงการเปลี่ยนภาพระหว่างอุณหภูมิปฏิกิริยาที่แตกต่างกัน และลดเวลาการทดสอบลงอย่างมาก [62] (รูปที่ 3b)ในการศึกษาอื่นโดย Jung et al.[63] เสนอเครื่องวิเคราะห์พันธุกรรม PCR แบบหมุนใหม่ที่รวมคุณสมบัติของ PCR แบบคงที่และแบบโฟลว์สำหรับ PCR การถอดรหัสแบบย้อนกลับแบบเร็วพิเศษและแบบมัลติเพล็กซ์ (รูปที่ 3c)สำหรับการขยายกรดนิวคลีอิก ไมโครชิป PCR จะหมุนผ่านบล็อกความร้อนสามบล็อกที่อุณหภูมิต่างกัน: 1. บล็อกการเสื่อมสภาพ 94°C, 2. บล็อกการหลอมที่อุณหภูมิ 58°C, 3. บล็อกการขยายตัวที่อุณหภูมิ 72°C
การประยุกต์ใช้ PCR ในไมโครฟลูอิดิกส์การแสดงแผนผังของ dirRT-qPCR บนแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิก (ดัดแปลงจาก [60])b การแสดงแผนผังของไมโครอาร์เรย์ PCR แบบไหลต่อเนื่องตามช่องสัญญาณคดเคี้ยว (ดัดแปลงจาก [62])c การแสดงแผนผังของเครื่องวิเคราะห์พันธุกรรม PCR แบบโรตารี่ ซึ่งประกอบด้วยไมโครชิป บล็อกความร้อนสามบล็อก และสเต็ปเปอร์มอเตอร์ (ดัดแปลงมาจาก [63])d แผนภาพของ PCR การพาความร้อนด้วยการหมุนเหวี่ยงและการตั้งค่า (ดัดแปลงจาก [64])DirRT-qPCR ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสการถอดรหัสย้อนกลับเชิงปริมาณโดยตรง
การใช้เส้นเลือดฝอยและลูปหรือแม้กระทั่งแผ่นบาง PCR การพาความร้อนสามารถขยายกรดนิวคลีอิกได้อย่างรวดเร็วโดยการพาความร้อนตามธรรมชาติโดยไม่ต้องใช้ปั๊มภายนอกตัวอย่างเช่น แพล็ตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกโพลีเมอร์แบบไซคลิกได้รับการพัฒนาบนขั้นตอนการให้ความร้อนแบบหมุนที่ประดิษฐ์ขึ้นซึ่งใช้การหมุนเวียนทางความร้อนด้วยการหมุนเหวี่ยงในไมโครแชนเนล PCR loop [64] (รูปที่ 3d)สารละลายของปฏิกิริยาขับเคลื่อนโดยการพาความร้อน ซึ่งจะแลกเปลี่ยนอุณหภูมิสูงและต่ำอย่างต่อเนื่องในไมโครแชนเนลที่มีโครงสร้างเป็นวงแหวนกระบวนการขยายสัญญาณทั้งหมดสามารถทำได้ภายใน 10 นาที โดยจำกัดการตรวจจับที่ 70.5 pg/ช่องสัญญาณ
ตามที่คาดไว้ PCR แบบรวดเร็วเป็นเครื่องมือที่ทรงพลังสำหรับระบบวิเคราะห์ระดับโมเลกุลและมัลติเพล็กซ์ที่ตอบสนองต่อตัวอย่างที่ตอบสนองอย่างเต็มรูปแบบRapid PCR ช่วยลดเวลาที่ใช้ในการตรวจหา SARS-CoV-2 ได้อย่างมาก ซึ่งมีส่วนช่วยในการควบคุมการระบาดของ COVID-19 อย่างมีประสิทธิภาพ
PCR ต้องการวงจรความร้อนที่ซับซ้อนซึ่งไม่เหมาะกับ POCTไม่นานมานี้ เทคนิคการขยายอุณหภูมิด้วยความร้อนได้ถูกนำมาใช้กับไมโครฟลูอิดิกส์ ซึ่งรวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง LAMP, การขยายสัญญาณโพลีเมอร์รีคอมบิเนส (RPA) และการขยายตามลำดับกรดนิวคลีอิก [65,66,67,68]ด้วยเทคนิคเหล่านี้ กรดนิวคลีอิกจะถูกขยายที่อุณหภูมิคงที่ อำนวยความสะดวกในการสร้างอุปกรณ์ POCT แบบพกพาที่มีต้นทุนต่ำและมีความไวสูงสำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุล
การทดสอบ LAMP ที่ใช้ไมโครฟลูอิดิกส์ในปริมาณสูงช่วยให้สามารถตรวจหาโรคติดเชื้อได้หลายครั้ง [42, 69, 70, 71]เมื่อใช้ร่วมกับระบบไมโครฟลูอิดิกแบบแรงเหวี่ยง LAMP สามารถอำนวยความสะดวกในการตรวจหากรดนิวคลีอิกโดยอัตโนมัติ [69, 72, 73, 74, 75]SlipChip แบบหมุนและตอบสนองได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจจับด้วยสายตาของแบคทีเรียคู่ขนานหลายตัวโดยใช้ LAMP [76] (รูปที่ 4a)เมื่อใช้ LAMP ที่ปรับให้เหมาะสมในการทดสอบ อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนการเรืองแสงอยู่ที่ประมาณ 5 เท่า และขีดจำกัดการตรวจจับถึง 7.2 สำเนา/ไมโครลิตรของจีโนมดีเอ็นเอ นอกจากนี้ การมีอยู่ของแบคทีเรียก่อโรคในทางเดินอาหารทั่วไป 5 ชนิด ได้แก่ Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis และ Vibrio parahaemolyticus ถูกแสดงภาพโดยอิงจากวิธีการนี้ใน < 60 นาที นอกจากนี้ การมีอยู่ของแบคทีเรียก่อโรคในทางเดินอาหารทั่วไป 5 ชนิด ได้แก่ Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis และ Vibrio parahaemolyticus ถูกแสดงภาพโดยอิงจากวิธีการนี้ใน < 60 นาทีนอกจากนี้ การแสดงภาพการปรากฏตัวของแบคทีเรียก่อโรคทั่วไป 5 ชนิดในทางเดินอาหาร ได้แก่ Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis และ Vibrio parahaemolyticus โดยใช้วิธีนี้ในเวลาน้อยกว่า 60 นาที此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 ฮิปนอกจากนี้ การปรากฏตัวของแบคทีเรียก่อโรคในทางเดินอาหารทั่วไป 5 ชนิด ได้แก่ Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius และ Vibrio parahaemolyticus โดยใช้วิธีนี้ในเวลาน้อยกว่า 60 นาที
ข้อดีของ LAMP ในไมโครฟลูอิดิกส์ ได้แก่ การตอบสนองที่รวดเร็วและการตรวจจับที่ย่อขนาดอย่างไรก็ตาม เนื่องจากอุณหภูมิของปฏิกิริยา (ประมาณ 70°C) ละอองลอยจะถูกสร้างขึ้นอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ในระหว่าง LAMP ส่งผลให้มีอัตราการบวกลวงสูงการทดสอบจำเพาะ การออกแบบไพรเมอร์ และการควบคุมอุณหภูมิยังต้องได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับ LAMP ด้วยนอกจากนี้ การออกแบบชิปที่ใช้การตรวจจับเป้าหมายหลายจุดบนชิปตัวเดียวนั้นคุ้มค่ามากและควรได้รับการพัฒนานอกจากนี้ LAMP ยังเหมาะสำหรับการตรวจจับอเนกประสงค์ที่รวมอยู่ในชิปตัวเดียว ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่ง แต่ยังมีพื้นที่สำหรับการพัฒนาอีกมาก
อัตราบวกปลอมที่สูงของ LAMP สามารถลดลงได้บางส่วนด้วย RPA เนื่องจากอุณหภูมิปฏิกิริยาที่ค่อนข้างต่ำ (~37 °C) ส่งผลให้เกิดปัญหาการระเหยค่อนข้างน้อย [77]ในระบบ RPA ไพรเมอร์ที่ตรงกันข้ามสองตัวเริ่มต้นการสังเคราะห์ดีเอ็นเอโดยจับกับรีคอมบิเนสและการขยายสามารถเสร็จสิ้นภายใน 10 นาที [78,79,80,81]ดังนั้นกระบวนการ RPA ทั้งหมดจึงเร็วกว่า PCR หรือ LAMP มากในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการแสดงเทคโนโลยีไมโครฟลูอิดิกเพื่อปรับปรุงความเร็วและความแม่นยำของ RPA [82,83,84] เพิ่มเติมตัวอย่างเช่น Liu และคณะ[85] พัฒนาชุดทดสอบการขยายกำลังขยายโพลีเมอเรส recombinase การไหลด้านข้างแบบไมโครฟลูอิดิกสำหรับการตรวจจับอย่างรวดเร็วและละเอียดอ่อนของ SARS-CoV-2 โดยการรวม RPA แบบย้อนกลับ (RT-RPA) และระบบตรวจจับแถบทดสอบการไหลด้านข้างแบบสากลในระบบไมโครฟลูอิดิกเดียวรูปที่ 4b)ขีดจำกัดของการตรวจจับคือ 1 สำเนา/µl หรือ 30 สำเนา/ตัวอย่าง และการตรวจจับสามารถทำได้ในเวลาประมาณ 30 นาทีKong และคณะได้พัฒนาอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกที่สวมใส่ได้[86] ใช้อุณหภูมิของร่างกายและระบบตรวจจับการเรืองแสงบนโทรศัพท์มือถือเพื่อตรวจหา DNA ของ HIV-1 อย่างรวดเร็วและโดยตรงโดยใช้ RPA (รูปที่ 4c)การทดสอบ RPA ที่สวมใส่ได้จะตรวจจับลำดับเป้าหมาย 100 ชุด/มล. ภายใน 24 นาที ซึ่งแสดงให้เห็นศักยภาพที่ยอดเยี่ยมสำหรับการวินิจฉัยอย่างรวดเร็วของทารกที่ติดเชื้อ HIV-1 ในการตั้งค่าที่จำกัดทรัพยากร
การขยายไอโซเทอร์มอลในการทดสอบ ณ จุดดูแล (POCT)การพัฒนาและการผลิตสปินและปฏิกิริยา SlipChipหลังจากการเชื่อมด้วยพลาสมา ชิปด้านบนและด้านล่างถูกประกอบเข้ากับชุดน็อตเพื่อสร้างชิปสุดท้าย (ดัดแปลงจาก [76])b แผนผังของระบบ MI-IF-RPA สำหรับการตรวจจับ COVID-19 (ดัดแปลงมาจาก [85])c แผนผังของการทดสอบ RPA ที่สวมใส่ได้สำหรับการตรวจหา HIV-1 DNA อย่างรวดเร็ว (ดัดแปลงมาจาก [86])SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, HIV ไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์, RPA recombinase polymerase Flow amplification, ไดโอดเปล่งแสง LED, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Recombinase การขยายเสียง
RPA ที่ใช้ไมโครฟลูอิดิกมีการพัฒนาอย่างรวดเร็ว อย่างไรก็ตาม ต้นทุนในการผลิตเศษและการใช้ปฏิกิริยาสูงเกินไป และต้องลดลงเพื่อเพิ่มความพร้อมของเทคโนโลยีนี้นอกจากนี้ ความไวสูงของ RPA อาจส่งผลต่อการขยายผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีที่มีการปนเปื้อนข้อจำกัดเหล่านี้อาจส่งผลต่อการประยุกต์ใช้ RPA ในระบบไมโครฟลูอิดิกและสมควรได้รับการปรับปรุงเพิ่มเติมไพรเมอร์และโพรบที่ออกแบบมาอย่างดีสำหรับเป้าหมายต่างๆ ยังจำเป็นเพื่อปรับปรุงความเป็นไปได้ของกลยุทธ์ไมโครฟลูอิดิกที่ใช้ RPA ใน POCT
Cas13 และ Cas12a มีความสามารถในการแยกกรดนิวคลีอิกแบบสุ่ม ดังนั้นจึงสามารถพัฒนาเป็นเครื่องมือในการตรวจจับและวินิจฉัยได้Cas13 และ Cas12a ถูกกระตุ้นเมื่อจับกับ DNA หรือ RNA เป้าหมายตามลำดับเมื่อถูกกระตุ้น โปรตีนจะเริ่มแยกกรดนิวคลีอิกอื่นๆ ในบริเวณใกล้เคียง หลังจากนั้น RNA ที่กำหนดเป้าหมายที่กรดนิวคลีอิกที่จำเพาะต่อเชื้อโรคสามารถตัดแยกโพรบเรืองแสงที่ดับแล้วและปล่อยสารเรืองแสงได้ตามทฤษฎีนี้ Kellner และคณะ[87] พัฒนาวิธีการที่ใช้ Cas13 [การปลดล็อก Enzymatic Reporter ที่มีความไวสูงเฉพาะ (SHERLOCK)] และ Broughton et al[88] พัฒนาแนวทางอื่นตาม Cas12a [CRISPR Trans Reporter กำหนดเป้าหมาย DNA endonuclease (DTECR)]
ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีวิธีการต่างๆ ในการตรวจหากรดนิวคลีอิกตาม CRISPR [89, 90]วิธีการที่ใช้ CRISPR แบบทั่วไปมักใช้เวลานานและต้องใช้แรงงานมาก เนื่องจากมีหลายขั้นตอน รวมถึงการสกัดกรดนิวคลีอิก การขยายเสียง และการตรวจจับ CRISPRการสัมผัสกับของเหลวในอากาศอาจเพิ่มโอกาสของผลลัพธ์ที่เป็นเท็จจากข้อมูลข้างต้น ระบบที่ใช้ CRISPR นั้นต้องการการเพิ่มประสิทธิภาพอย่างมาก
แพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกที่ควบคุมด้วยลมซึ่งสามารถทำการวิเคราะห์ 24 ครั้งพร้อมกันได้รับการพัฒนาสำหรับแอปพลิเคชันการตรวจจับ CRISPR-Cas12a และ CRISPR-Cas13a [91]ระบบนี้มีอุปกรณ์ตรวจจับการเรืองแสงซึ่งข้ามการขยายกรดนิวคลีอิกและตรวจจับตัวอย่าง DNA และ RNA ของ femtomolar โดยอัตโนมัติเฉินและคณะ[92] การขยายรีคอมบิเนสแบบรวมเข้ากับระบบ CRISPR-Cas12a ในไมโครฟลูอิดิกส์แบบแรงเหวี่ยง (รูปที่ 5a)งานนี้เอาชนะความยากลำบากในการรวมกระบวนการทั้งสองนี้ เนื่องจาก Cas12a สามารถย่อย DNA ผู้ส่งสารและยับยั้งกระบวนการขยายสัญญาณนอกจากนี้ Chen et al.[92] เก็บรีเอเจนต์ของปฏิกิริยาล่วงหน้าเพิ่มเติมในการควบคุมไมโครฟลูอิดิกแบบแรงเหวี่ยงเพื่อทำให้กระบวนการทั้งหมดสมบูรณ์โดยอัตโนมัติในงานอื่น Silva et al.[93] พัฒนาวิธีการวินิจฉัยโดยไม่มีการขยาย CRISPR/Cas12a และสมาร์ทโฟนเพื่อตรวจหา SARS-CoV-2 (รูปที่ 5b)การทดสอบนี้เรียกว่าระบบที่ไม่มีการขยายสัญญาณโดยใช้โทรศัพท์มือถือ ซึ่งรวมถึงเอนไซม์ที่ขึ้นกับ CRISPR/Cas ซึ่งอิงจากการแสดงภาพสัญญาณฟองสบู่ที่สร้างด้วยคาตาเลสบนสมาร์ทโฟนในช่องไมโครฟลูอิดิกการตรวจจับที่ละเอียดอ่อนของกรดนิวคลีอิกน้อยกว่า 50 ชุด/ไมโครลิตรโดยไม่มีการขยายสัญญาณล่วงหน้า กระบวนการทั้งหมดตั้งแต่การฉีดตัวอย่างไปจนถึงการอ่านสัญญาณใช้เวลาเพียง 71 นาที
วิธีการตรวจหากรดนิวคลีอิกตาม CRISPRPOCT แบบแรงเหวี่ยงสำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลแบบบูรณาการตาม CRISPR (ดัดแปลงมาจาก [92])b การพัฒนาการทดสอบ CASCADE สำหรับการวิเคราะห์ SARS-CoV-2 บนสมาร์ทโฟน (ดัดแปลงจาก [93])การขยาย RAA recombinase, PAM ต้นแบบโปรโตสเปเซอร์ที่อยู่ติดกัน, CRISPR คลัสเตอร์สั้น palindromic ซ้ำในช่วงเวลาปกติ, ระบบ CASCADE โดยไม่มีการขยายโทรศัพท์มือถือด้วยเอนไซม์ที่ขึ้นกับ CRISPR/CAS, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride EDC
เนื่องจากเป็นขั้นตอนสุดท้ายในการตรวจจับกรดนิวคลีอิก การตรวจจับสัญญาณจะสะท้อนผลการวินิจฉัยโดยตรงและเป็นปัจจัยสำคัญในการพัฒนา POCT ที่มีประสิทธิภาพ ละเอียดอ่อน และแม่นยำสามารถอ่านสัญญาณได้โดยใช้วิธีการต่างๆ เช่น กลยุทธ์ฟลูออเรสเซนต์ ไฟฟ้าเคมี การวัดสี และแม่เหล็กในส่วนนี้ เราจะอธิบายเหตุผลของแต่ละวิธีและเปรียบเทียบการวินิจฉัยระดับโมเลกุลของโรคติดเชื้อในไมโครฟลูอิดิกส์
กลยุทธ์ที่ใช้สารเรืองแสงใช้กันอย่างแพร่หลายในการวินิจฉัยโรคติดเชื้อ POCT เนื่องจากมีข้อได้เปรียบที่โดดเด่นของความไวที่ยอดเยี่ยม ต้นทุนต่ำ ความง่ายในการใช้งาน และการวิเคราะห์ ณ จุดดูแล [94, 95]กลยุทธ์เหล่านี้ใช้ฟลูออโรฟอร์ที่ติดฉลาก เช่น สีย้อมเรืองแสงและวัสดุนาโนเพื่อสร้างสัญญาณที่ตรวจจับได้ (การเพิ่มประสิทธิภาพการเรืองแสงหรือการดับ)การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่ากลยุทธ์ที่ใช้การเรืองแสงสามารถแบ่งออกเป็นการติดฉลากเรืองแสงโดยตรง การตรวจจับเรืองแสงแบบสัญญาณและแบบปิดสัญญาณ [96]การตรวจจับฉลากเรืองแสงโดยตรงใช้ฉลากเรืองแสงพิเศษเพื่อติดฉลากลิแกนด์เฉพาะที่สร้างปริมาณการเรืองแสงเฉพาะเมื่อเลือกผูกกับเป้าหมายสำหรับการตรวจจับการเรืองแสงตามสัญญาณ คุณภาพของสัญญาณเรืองแสงมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับขนาดที่สนใจความเข้มของการเรืองแสงจะเล็กน้อยเมื่อไม่มีเป้าหมาย และตรวจพบได้เมื่อมีเป้าหมายในปริมาณที่เพียงพอในทางกลับกัน ความเข้มของการเรืองแสงที่ตรวจพบโดยการเรืองแสง "ปิดสัญญาณ" จะแปรผกผันกับปริมาณของเป้าหมาย โดยเริ่มแรกถึงค่าสูงสุดและค่อยๆ ลดลงเมื่อเป้าหมายถูกขยายตัวอย่างเช่น การใช้กลไกการแตกแยกที่ขึ้นกับเป้าหมาย CRISPR-Cas13a, Tian et al[97] พัฒนากลยุทธ์การจดจำแบบใหม่เพื่อตรวจจับ RNA ที่เลี่ยงการถอดรหัสแบบย้อนกลับโดยตรง (รูปที่ 6a)เมื่อจับกับ RNA เป้าหมายเสริม สารเชิงซ้อน CRISPR-Cas13-RNA สามารถเปิดใช้งานได้ ซึ่งจะกระตุ้นการแตกแยกของ transcollateral โดย RNA ของนักข่าวที่ไม่เฉพาะเจาะจงนักข่าวที่ติดฉลากเรืองแสง [fluorophore (F)] ถูกดับโดยตัวดับ (Q) ที่ไม่บุบสลายและเรืองแสงเมื่อถูกแยกออกโดยสารเชิงซ้อนที่กระตุ้น
ข้อดีของการตรวจจับด้วยไฟฟ้าเคมีคือ ความเร็วในการตรวจจับสูง การผลิตง่าย ต้นทุนต่ำ พกพาสะดวก และการควบคุมอัตโนมัติเป็นวิธีวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพสำหรับการใช้งาน POCTอิงจากทรานซิสเตอร์แบบเอฟเฟกต์สนามกราฟีน Gao et al.[98] พัฒนานาโนไบโอเซนเซอร์สำหรับการตรวจหามัลติเพล็กซ์ของแอนติเจนโรค Lyme จากแบคทีเรีย Borrelia burgdorferi ด้วยขีดจำกัดการตรวจจับที่ 2 pg/mL (รูปที่ 6b)
การทดสอบด้วยสีถูกนำมาใช้ในแอปพลิเคชัน POCT โดยได้ประโยชน์จากข้อดีของการพกพา ต้นทุนต่ำ ความสะดวกในการเตรียมการ และการอ่านด้วยภาพการตรวจจับด้วยสีสามารถใช้การออกซิเดชันของวัสดุนาโนที่คล้ายเปอร์ออกซิเดสหรือเปอร์ออกซิเดส การรวมตัวของวัสดุนาโน และการเพิ่มสีย้อมบ่งชี้เพื่อแปลงข้อมูลเกี่ยวกับการมีอยู่ของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายเป็นการเปลี่ยนสีที่มองเห็นได้ [99, 100, 101]โดยเฉพาะอย่างยิ่ง อนุภาคนาโนทองคำมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการพัฒนากลยุทธ์การวัดสี และเนื่องจากความสามารถในการทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของสีอย่างรวดเร็วและมีนัยสำคัญ จึงมีความสนใจเพิ่มขึ้นในการพัฒนาแพลตฟอร์มสี POCT สำหรับการวินิจฉัยโรคติดเชื้อในแหล่งกำเนิด [102]ด้วยอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกแบบหมุนเหวี่ยงในตัว [103] เชื้อโรคที่เกิดจากอาหารในตัวอย่างนมที่ปนเปื้อนสามารถตรวจพบได้โดยอัตโนมัติที่ระดับ 10 เซลล์แบคทีเรีย และสามารถอ่านผลลัพธ์ได้ด้วยสายตาภายใน 65 นาที (รูปที่ 6c)
เทคนิคการตรวจจับแม่เหล็กสามารถตรวจจับการวิเคราะห์ได้อย่างแม่นยำโดยใช้วัสดุที่เป็นแม่เหล็ก และมีความสนใจอย่างมากในการใช้งาน POCT ในช่วงหลายทศวรรษที่ผ่านมาเทคนิคการตรวจจับแม่เหล็กมีข้อดีเฉพาะบางอย่าง เช่น วัสดุแม่เหล็กที่มีต้นทุนต่ำ แทนที่จะเป็นส่วนประกอบทางแสงที่มีราคาแพงอย่างไรก็ตาม การใช้สนามแม่เหล็กช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการตรวจจับและลดเวลาในการเตรียมตัวอย่าง [104]นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของโพรบแม่เหล็กยังแสดงให้เห็นความจำเพาะ ความไว และอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสูง เนื่องจากสัญญาณพื้นหลังแม่เหล็กที่ไม่มีนัยสำคัญของตัวอย่างทางชีววิทยา [105]ชาร์มาและคณะรวมไบโอเซนเซอร์ที่ใช้ทางแยกอุโมงค์แม่เหล็กเข้ากับแพลตฟอร์มไมโครชิปแบบพกพา[106] สำหรับการตรวจหาเชื้อโรคแบบมัลติเพล็กซ์ (รูปที่ 6d)ไบโอเซนเซอร์ตรวจจับกรดนิวคลีอิกใต้นาโนโมลาร์ที่แยกได้จากเชื้อโรคอย่างละเอียดอ่อน
วิธีการตรวจจับสัญญาณทั่วไปแนวคิดของการตรวจจับแบบไฮเปอร์โลคัลไลซ์ของ Cas13a (ดัดแปลงมาจาก [97])b Graphene nanobiosensor FET ร่วมกับ Lyme GroES scFv (ดัดแปลงมาจาก [98])c ตัวบ่งชี้สีสำหรับการตรวจจับมัลติเพล็กซ์ของเชื้อโรคที่เกิดจากอาหารในชิปไมโครฟลูอิดิกแบบหมุนเหวี่ยง: ตัวอย่างหมายเลข 1 และหมายเลข 3 ที่มีเชื้อโรคเป้าหมาย และตัวอย่างหมายเลข 2 ลำดับ 4 และหมายเลข 5 ที่ไม่มีเชื้อโรคเป้าหมาย (ดัดแปลงจาก [103]) .d ไบโอเซนเซอร์ตามชุมทางอุโมงค์แม่เหล็ก รวมถึงแพลตฟอร์ม แอมพลิฟายเออร์บล็อกในตัว ชุดควบคุม และแหล่งจ่ายไฟสำหรับการสร้าง/รับสัญญาณ (ดัดแปลงจาก [106])GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA พอลิเมทิลเมทาคริเลต
แม้จะมีคุณลักษณะที่ยอดเยี่ยมของวิธีการตรวจจับข้างต้น แต่ก็ยังมีข้อเสียอยู่เปรียบเทียบวิธีการเหล่านี้ (ตารางที่ 1) รวมถึงบางแอปพลิเคชันที่มีรายละเอียด (ข้อดีและข้อเสีย)
ด้วยการพัฒนาไมโครฟลูอิดิกส์ ระบบไมโครไฟฟ้า นาโนเทคโนโลยีและวัสดุศาสตร์ การใช้ไมโครฟลูอิดิกชิปในการตรวจหาโรคติดเชื้อมีความก้าวหน้าอย่างต่อเนื่อง [55,96,107,108]การจัดการอุปกรณ์ขนาดเล็กและของเหลวอย่างแม่นยำช่วยให้การวินิจฉัยแม่นยำและคุ้มค่าดังนั้น เพื่อการพัฒนาต่อไป จึงมีความพยายามในการเพิ่มประสิทธิภาพและอัพเกรดชิป ส่งผลให้ชิปไมโครฟลูอิดิกต่างๆ มีโครงสร้างและหน้าที่ต่างกันในที่นี้เราจะแนะนำแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกทั่วไปหลายประเภทโดยสังเขปและเปรียบเทียบคุณลักษณะ (ข้อดีและข้อเสีย)นอกจากนี้ ตัวอย่างส่วนใหญ่ที่แสดงด้านล่างเน้นที่การต่อสู้กับ SARS-CoV-2 เป็นหลัก
LOCC เป็นระบบวิเคราะห์ที่ซับซ้อนขนาดเล็กที่สุดที่พบได้บ่อยที่สุด และการปฏิบัติงานของพวกเขาได้รับการย่อขนาดสูง บูรณาการ อัตโนมัติ และขนานจากการฉีดตัวอย่างและการเตรียมการ การควบคุมการไหลและการตรวจจับของเหลว [109, 110]ของเหลวได้รับการจัดการผ่านรูปทรงที่ออกแบบอย่างพิถีพิถันและปฏิกิริยาของผลกระทบทางกายภาพหลายอย่าง เช่น การไล่ระดับแรงดัน การกระทำของเส้นเลือดฝอย อิเล็กโทรไดนามิก สนามแม่เหล็ก และคลื่นเสียง [111]LOCC แสดงให้เห็นถึงข้อได้เปรียบที่ยอดเยี่ยมในการคัดกรองปริมาณงานสูงและการตรวจจับหลายรายการ ด้วยความเร็วในการวิเคราะห์ที่รวดเร็ว ขนาดตัวอย่างที่เล็ก การใช้พลังงานต่ำ และการจัดการและประสิทธิภาพการทำงานที่สูงอย่างไรก็ตาม อุปกรณ์ LOCC นั้นบอบบางมาก ทั้งการผลิต บรรจุภัณฑ์ และการเชื่อมต่ออย่างไรก็ตาม การทำมัลติเพล็กซ์และการนำกลับมาใช้ใหม่ประสบปัญหาอย่างมาก [96]เมื่อเทียบกับแพลตฟอร์มอื่นๆ LOCC มีข้อได้เปรียบที่ไม่เหมือนใครในแง่ของความหลากหลายของแอปพลิเคชันสูงสุดและความเข้ากันได้ของเทคโนโลยีที่ดีที่สุด แต่ข้อเสียของมันก็ชัดเจนเช่นกัน คือ ความซับซ้อนสูงและความสามารถในการทำซ้ำได้ไม่ดีการพึ่งพาปั๊มภายนอกซึ่งมักจะเทอะทะและมีราคาแพง ทำให้จำกัดการใช้งานใน POCT เพิ่มเติม
ในช่วงการระบาดของ COVID-19 LOCC ได้รับความสนใจเป็นอย่างมากในขณะเดียวกันก็มีชิปใหม่ๆ หลายตัวที่รวมเอาเทคโนโลยีต่างๆ เข้าไว้ด้วยกันตัวอย่างเช่น สมาร์ทโฟนถูกใช้อย่างกว้างขวางเป็นอุปกรณ์วิเคราะห์แบบพกพาและมีศักยภาพที่ดีในการรวม LOCCซันและคณะ[21] ประดิษฐ์ไมโครฟลูอิดิกชิปที่ช่วยให้ลำดับกรดนิวคลีอิกจำเพาะของเชื้อโรคห้าชนิด ซึ่งรวมถึงซาร์ส-โควี-2 โดยใช้ LAMP และวิเคราะห์โดยใช้สมาร์ทโฟนภายใน 1 ชั่วโมงหลังจากสิ้นสุดปฏิกิริยาอีกตัวอย่างหนึ่ง ซุนดาห์และคณะ[112] สร้างสวิตช์ระดับโมเลกุล [การขยายตัวเร่งปฏิกิริยาโดยสวิตช์สถานะการเปลี่ยนระดับโมเลกุล (CATCH)] สำหรับการตรวจจับโดยตรงและละเอียดอ่อนของเป้าหมาย RNA SARS-CoV-2 โดยใช้สมาร์ทโฟน CATCH เข้ากันได้กับ LOCC แบบพกพาและให้ประสิทธิภาพที่เหนือกว่า (สำเนา RNA ประมาณ 8 สำเนา/ไมโครลิตร; < 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง) [112] CATCH เข้ากันได้กับ LOCC แบบพกพาและให้ประสิทธิภาพที่เหนือกว่า (สำเนา RNA ประมาณ 8 สำเนา/ไมโครลิตร; < 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง) [112] จับ совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копичодную производительность (примерно 8 копий рннт.1 рномот рном. CATCH เข้ากันได้กับ LOCC แบบพกพาและให้ปริมาณงานที่ยอดเยี่ยม (สำเนา RNA ประมาณ 8 สำเนา/µl; < 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง) [112] CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 จับ совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 конича РНк. 1 к./мк. CATCH เข้ากันได้กับ LOCC แบบพกพาและมีประสิทธิภาพที่ยอดเยี่ยม (สำเนา RNA ประมาณ 8 สำเนา/µl; < 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง) [112]นอกจากนี้ อุปกรณ์ LOCC สำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลยังใช้แรงขับเคลื่อนบางอย่าง เช่น สุญญากาศ การยืดตัว และสนามไฟฟ้าคัง et al.[113] สาธิต PCR nanoplasma-on-a-chip แบบเรียลไทม์และรวดเร็วเป็นพิเศษสำหรับการวินิจฉัยโรค COVID-19 ในเชิงปริมาณอย่างรวดเร็วและรวดเร็วในภาคสนามโดยใช้ชิป PCR ของเหลวพลาสโมนิกสูญญากาศหลี่และคณะ[114] ต่อมาได้พัฒนาชิปไมโครฟลูอิดิกแบบยืดได้ ซึ่งสามารถวินิจฉัยโรคโควิด-19 ได้แพลตฟอร์มนี้ใช้ระบบขยายสัญญาณ RT-LAMP เพื่อตรวจสอบว่าตัวอย่างเป็นบวกหรือลบในเชิงคุณภาพต่อมา Ramachandran et al.[115] บรรลุการไล่ระดับสนามไฟฟ้าที่เหมาะสมโดยใช้ไอโซทาโชฟอเรซิส (ITP) ซึ่งเป็นเทคนิคการเน้นไอออนแบบคัดเลือกที่นำมาใช้ในไมโครฟลูอิดิกส์ด้วย ITP ทำให้ RNA เป้าหมายจากตัวอย่างเนื้อเยื่อโพรงจมูกดิบสามารถทำให้บริสุทธิ์ได้โดยอัตโนมัติแล้วรามจันทรันและคณะ[115] การรวมการทำให้บริสุทธิ์ของ ITP นี้กับการตรวจด้วย LAMP และ CRISPR ที่ปรับปรุงด้วย ITP ตรวจพบ SARS-CoV-2 ในผ้าเช็ดทำความสะอาดโพรงจมูกของมนุษย์และตัวอย่างทางคลินิกในเวลาประมาณ 35 นาทีนอกจากนี้ยังมีแนวคิดใหม่ๆ เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องJadhav และคณะ[116] เสนอแผนการวินิจฉัยโดยใช้ Raman spectroscopy ที่ปรับปรุงพื้นผิวร่วมกับอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกที่มีท่อนาโนคาร์บอนเคลือบทอง/เงินในแนวตั้งหรือหลอดไมโคร/นาโนอิเล็กโทรสปันแบบใช้แล้วทิ้งไมโครแชนเนลตัวกรองในตัวที่ทำงานด้วยเมมเบรนเป็นแบบใช้แล้วทิ้งอุปกรณ์ดูดซับไวรัสจากของเหลวในร่างกาย/สารคัดหลั่งต่างๆ เช่น น้ำลาย ช่องจมูก และน้ำตาดังนั้น ระดับไวรัสจึงมีมากมายและสามารถระบุไวรัสได้อย่างแม่นยำด้วยลายเซ็นรามัน
LOAD เป็นแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกแบบแรงเหวี่ยงซึ่งกระบวนการทั้งหมดจะถูกควบคุมโดยโปรโตคอลความถี่ที่หมุนซับสเตรตที่มีโครงสร้างจุลภาค [110]อุปกรณ์ LOAD มีลักษณะเฉพาะโดยใช้แรงเหวี่ยงหนีศูนย์กลางเป็นแรงผลักดันที่สำคัญของเหลวยังอยู่ภายใต้แรงของเส้นเลือดฝอย ออยเลอร์ และโคริโอลิสการใช้อุปกรณ์หมุนเหวี่ยง การวิเคราะห์จะดำเนินการในการทำงานของของเหลวอย่างต่อเนื่องจากตำแหน่งเข้าด้านในเป็นแนวรัศมีไปยังตำแหน่งออกด้านนอก ขจัดความจำเป็นในการเพิ่มท่อภายนอก ปั๊ม แอคทูเอเตอร์ และวาล์วแอกทีฟกล่าวโดยสรุป วิธีการควบคุมแบบเดียวทำให้การทำงานง่ายขึ้นแรงที่กระทำต่อของเหลวในช่องไมโครฟลูอิดิกเดียวกันที่ระยะห่างจากศูนย์กลางโหลดเท่ากัน ซึ่งทำให้สามารถทำซ้ำโครงสร้างช่องสัญญาณได้ดังนั้น อุปกรณ์ LOAD จึงออกแบบและผลิตได้ง่ายและประหยัดกว่าอุปกรณ์ LOCC ทั่วไป ในขณะที่ปฏิกิริยาส่วนใหญ่จะเป็นอิสระและขนานกันอย่างไรก็ตาม เนื่องจากอุปกรณ์แบบแรงเหวี่ยงมีความแข็งแรงทางกลสูง วัสดุเศษที่มีอยู่จึงมีจำกัดและผลิตในปริมาณน้อยได้ยากไปที่รถในเวลาเดียวกัน อุปกรณ์ LOAD ส่วนใหญ่ได้รับการออกแบบสำหรับใช้ครั้งเดียวเท่านั้น ซึ่งมีราคาแพงสำหรับการตรวจจับขนาดใหญ่ [96, 117, 118, 119]
ในทศวรรษที่ผ่านมา LOAD ซึ่งถือเป็นหนึ่งในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกที่มีแนวโน้มมากที่สุด ได้รับความสนใจอย่างมากจากนักวิจัยและผู้ผลิตดังนั้น LOAD จึงได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางและถูกนำมาใช้ในการวินิจฉัยระดับโมเลกุลของเชื้อโรคติดเชื้อ [120, 121, 122, 123, 124] โดยเฉพาะอย่างยิ่งในช่วงการระบาดของ COVID-19ตัวอย่างเช่น ณ สิ้นปี 2020 Ji et al.[60] แสดงให้เห็นการทดสอบ RT-qPCR โดยตรงสำหรับการตรวจหา SARS-CoV-2 และการติดเชื้อไข้หวัดใหญ่ A และ B แบบคู่ขนานอย่างรวดเร็วและอัตโนมัติในตัวอย่างเนื้อเยื่อคอจากนั้น Xiong และคณะ[74] นำเสนอแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกดิสคอยด์แบบรวม LAMP สำหรับการตรวจหาไวรัสโคโรน่าระบบทางเดินหายใจของมนุษย์ทั้งเจ็ดอย่างรวดเร็ว แม่นยำ และพร้อมๆ กัน รวมถึง SARS-CoV-2 ภายใน 40 นาทีในต้นปี 2564 de Oliveira et al.[73] สาธิตชิปไมโครฟลูอิดิกโพลีสไตรีนโทนเนอร์แบบแรงเหวี่ยง ซึ่งดำเนินการด้วยตนเองด้วยเครื่องหมุนปลายนิ้ว สำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลของ RT-LAMP ของโควิด-19ต่อจากนั้น Dignan และคณะ[39] นำเสนอไมโครดีไวซ์แบบหมุนเหวี่ยงแบบพกพาแบบอัตโนมัติสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของ SARS-CoV-2 RNA โดยตรงจากส่วนกระพุ้งแก้มเมดเวดและคณะ[53] เสนอระบบสุ่มตัวอย่างละออง SARS-CoV-2 แบบอินไลน์ด้วยชิปเรืองแสงไมโครฟลูอิดิกแบบหมุนปริมาตรขนาดเล็กที่มีขีดจำกัดการตรวจจับ 10 ชุด/ไมโครลิตรและขีดจำกัดรอบขั้นต่ำ 15 นาทีซัวเรซ และคณะ[75] เมื่อเร็ว ๆ นี้รายงานการพัฒนาแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกแบบแยกส่วนแบบบูรณาการสำหรับการตรวจหา SARS-CoV-2 RNA โดยตรงในตัวอย่างผ้าเช็ดทำความสะอาดโพรงจมูกที่ปิดการทำงานด้วยความร้อนโดยใช้ LAMPตัวอย่างเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงประโยชน์อันยิ่งใหญ่และคำมั่นสัญญาของ LOAD ในการวินิจฉัยระดับโมเลกุลของ COVID-19
ในปี 1945 Muller และ Clegg [125] ได้นำเสนอช่องไมโครฟลูอิดิกบนกระดาษเป็นครั้งแรกโดยใช้กระดาษกรองและพาราฟินในปี 2550 กลุ่ม Whitesides [126] ได้สร้างแพลตฟอร์มกระดาษที่ใช้งานได้เป็นครั้งแรกสำหรับการทดสอบโปรตีนและกลูโคสกระดาษได้กลายเป็นสารตั้งต้นในอุดมคติสำหรับไมโครฟลูอิดิกส์กระดาษมีคุณสมบัติโดยธรรมชาติ เช่น ความชอบน้ำและโครงสร้างที่มีรูพรุน ความเข้ากันได้ทางชีวภาพที่ดีเยี่ยม น้ำหนักเบา ความยืดหยุ่น ความสามารถในการพับ ต้นทุนต่ำ ใช้งานง่ายและสะดวกµPAD แบบคลาสสิกประกอบด้วยโครงสร้างที่ชอบน้ำ/ไม่ชอบน้ำที่สร้างขึ้นบนกระดาษซับสเตรตขึ้นอยู่กับโครงสร้างสามมิติ μPAD สามารถแบ่งออกเป็น μPAD แบบสองมิติ (2D) และสามมิติ (3D) ได้2D µPADs ถูกผลิตขึ้นโดยการสร้างขอบเขตที่ไม่ชอบน้ำเพื่อสร้างช่องไมโครฟลูอิดิก ในขณะที่ 3D µPAD มักจะทำจากชั้นของกระดาษไมโครฟลูอิดิก 2 มิติ บางครั้งเกิดจากการพับกระดาษ เทคนิคการลื่น ช่องเปิด และการพิมพ์ 3 มิติ [96]ของเหลวที่เป็นน้ำหรือของเหลวชีวภาพบน μPAD ถูกควบคุมโดยหลักโดยแรงของเส้นเลือดฝอยโดยไม่มีแหล่งพลังงานภายนอก ซึ่งอำนวยความสะดวกในการจัดเก็บรีเอเจนต์ล่วงหน้า การจัดการตัวอย่าง และการตรวจจับมัลติเพล็กซ์อย่างไรก็ตาม การควบคุมการไหลที่แม่นยำและการตรวจจับมัลติเพล็กซ์ถูกขัดขวางโดยความเร็วในการตรวจจับ ความไว และความสามารถในการนำกลับมาใช้ใหม่ไม่เพียงพอ [96, 127, 128, 129, 130]
ในฐานะที่เป็นแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกที่ผิดปกติ μPAD ได้รับการส่งเสริมและพัฒนาอย่างกว้างขวางสำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลของโรคติดเชื้อ เช่น HCV, HIV และ SARS-CoV-2 [131, 132]สำหรับการตรวจหา HCV แบบเฉพาะเจาะจงและละเอียดอ่อน Tengam et al.[133] พัฒนาไบโอเซนเซอร์แบบใหม่โดยใช้กระดาษเรืองแสงโดยใช้โพรบกรดนิวคลีอิกที่มีความจำเพาะสูงซึ่งใช้เปปไทด์ไพร์โรลิดินิลกรดนิวคลีอิกถูกตรึงโควาเลนต์บนกระดาษเซลลูโลสที่ออกซิไดซ์บางส่วนโดยอัลคิเลชันแบบรีดักทีฟระหว่างกลุ่มอะมิโนและกลุ่มอัลดีไฮด์ และการตรวจจับจะขึ้นอยู่กับการเรืองแสงสัญญาณเหล่านี้สามารถอ่านได้โดยอุปกรณ์ที่ทำขึ้นเป็นพิเศษด้วยกล้องเรืองแสงแบบพกพาร่วมกับกล้องโทรศัพท์มือถือต่อจากนั้น Lu et al.[134] ออกแบบอิเล็กโทรดแบบยืดหยุ่นที่ใช้กระดาษโดยใช้อนุภาคนาโนนิกเกิล/ทอง/ท่อนาโนคาร์บอน/พอลิไวนิลแอลกอฮอล์ออร์แกนิกเฟรมเวิร์กคอมโพสิตสำหรับการตรวจหาเป้าหมายเอชไอวีโดยการผสมดีเอ็นเอโดยใช้เมทิลีนบลูเป็นตัวบ่งชี้ดีเอ็นเอรีดอกซ์อีกไม่นาน Chowdury et al.[135] นำเสนอการออกแบบแพลตฟอร์มสมมุติฐานสำหรับการทดสอบ µPAD ณ จุดดูแลโดยใช้น้ำลายของผู้ป่วยดิบร่วมกับ LAMP และเทคโนโลยีการถ่ายภาพแบบพกพาสำหรับการตรวจจับสารวิเคราะห์ COVID-19
การทดสอบการไหลด้านข้างจะแนะนำของไหลโดยแรงของเส้นเลือดฝอยและควบคุมการเคลื่อนที่ของของไหลโดยความเปียกชื้นและคุณลักษณะของซับสเตรตที่มีรูพรุนหรือโครงสร้างจุลภาคอุปกรณ์การไหลด้านข้างประกอบด้วยตัวอย่าง คอนจูเกต ตู้ฟักไข่และการตรวจจับ และแผ่นดูดซับโมเลกุลกรดนิวคลีอิกใน LFA รับรู้สารยึดเกาะจำเพาะที่ถูกเก็บไว้ล่วงหน้าที่ตำแหน่งการจับและจับเป็นสารเชิงซ้อนเมื่อของเหลวผ่านเข้าไปในแผ่นฟักไข่และแผ่นตรวจจับ สารเชิงซ้อนจะถูกจับโดยโมเลกุลการจับที่อยู่บนเส้นทดสอบและสายควบคุม ซึ่งแสดงผลที่สามารถอ่านได้โดยตรงด้วยตาเปล่าโดยทั่วไปแล้ว LFA สามารถทำได้ภายใน 2-15 นาที ซึ่งเร็วกว่าการค้นพบแบบเดิมเนื่องจากกลไกพิเศษ LFA จึงมีการดำเนินการเพียงเล็กน้อยและไม่ต้องการอุปกรณ์เพิ่มเติม ซึ่งทำให้ใช้งานง่ายมากง่ายต่อการผลิตและย่อให้เล็กลง และต้นทุนของวัสดุพิมพ์ที่ใช้กระดาษก็ถูกลงอย่างไรก็ตาม จะใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพเท่านั้น และการตรวจจับเชิงปริมาณทำได้ยากมาก และความสามารถในการมัลติเพล็กซ์และปริมาณงานมีจำกัด และสามารถตรวจพบกรดนิวคลีอิกที่เพียงพอในแต่ละครั้งเท่านั้น [96,110,127]
แม้ว่าการประยุกต์ใช้ LFA ส่วนใหญ่จะเน้นไปที่การตรวจอิมมูโนแอสเซย์ แต่การใช้ LFA สำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลในชิปไมโครฟลูอิดิกก็มีประสิทธิภาพและเป็นที่นิยมเช่นกัน [136]ในกรณีของไวรัสตับอักเสบบี HIV และ SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] เสนอแพลตฟอร์ม LFA ของอนุภาคนาโนแบบ up-conversion และแสดงให้เห็นถึงความเก่งกาจของแพลตฟอร์มขนาดเล็กและแบบพกพานี้ผ่านการตรวจจับที่ละเอียดอ่อนและเชิงปริมาณของเป้าหมายหลายตัว เช่น กรดนิวคลีอิก HBVนอกจากนี้ Fu et al.[138] สาธิต LFA ใหม่โดยใช้ Raman spectroscopy ที่ปรับปรุงพื้นผิวสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ DNA HIV-1 ที่ความเข้มข้นต่ำเพื่อการตรวจหา SARS-CoV-2 ที่รวดเร็วและละเอียดอ่อน Liu et al.[85] พัฒนาการวิเคราะห์การไหลด้านข้าง RPA ด้านข้างที่รวมไมโครฟลูอิดิกโดยการรวม RT-RPA และระบบตรวจจับการไหลด้านข้างสากลเข้าไว้ในระบบไมโครฟลูอิดิกเดียว
การประยุกต์ใช้แพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกต่างๆ จะแตกต่างกันไปตามการศึกษาที่เฉพาะเจาะจง โดยใช้ประโยชน์จากความสามารถและข้อดีของแพลตฟอร์มอย่างเต็มที่ด้วยวาล์ว ปั๊ม และท่อที่มีราคาจับต้องได้ LOCC จึงเป็นแพลตฟอร์มที่ครอบคลุมมากที่สุดสำหรับความหลากหลายของการใช้งานและความสามารถในการทำงานร่วมกัน พร้อมพื้นที่สำหรับการพัฒนาที่ดีที่สุดดังนั้นเราจึงหวังและแนะนำให้ทำการศึกษาใหม่ล่าสุดที่ LOCC เป็นความพยายามครั้งแรกและปรับเงื่อนไขให้เหมาะสมนอกจากนี้คาดว่าจะมีการค้นพบและใช้วิธีการที่มีประสิทธิภาพและแม่นยำยิ่งขึ้นในระบบLOAD เป็นเลิศในการควบคุมของเหลวอย่างแม่นยำจากอุปกรณ์ LOCC ที่มีอยู่ และแสดงให้เห็นถึงข้อได้เปรียบที่ไม่เหมือนใครในไดรฟ์เดี่ยวด้วยแรงเหวี่ยงหนีศูนย์กลางโดยไม่ต้องใช้ไดรฟ์ภายนอก ในขณะที่การตอบสนองแบบขนานสามารถแยกและซิงโครไนซ์ได้ดังนั้น ในอนาคต LOAD จะกลายเป็นแพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกหลักที่มีการดำเนินการแบบแมนนวลน้อยลงและเทคโนโลยีที่มีความเป็นผู้ใหญ่และเป็นอัตโนมัติมากขึ้นแพลตฟอร์ม µPAD ผสมผสานประโยชน์ของ LOCC และวัสดุที่เป็นกระดาษสำหรับการวินิจฉัยแบบใช้ครั้งเดียวต้นทุนต่ำดังนั้นการพัฒนาในอนาคตจึงควรเน้นที่เทคโนโลยีที่สะดวกและเป็นที่ยอมรับนอกจากนี้ LFA ยังเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการตรวจจับด้วยตาเปล่า ซึ่งสัญญาว่าจะลดการใช้ตัวอย่างและเร่งการตรวจจับให้เร็วขึ้นการเปรียบเทียบแพลตฟอร์มโดยละเอียดแสดงในตารางที่ 2
การวิเคราะห์แบบดิจิทัลจะแบ่งตัวอย่างออกเป็นไมโครรีแอคเตอร์จำนวนมาก ซึ่งแต่ละอันมีโมเลกุลเป้าหมายที่ไม่ต่อเนื่อง [139, 140]การทดสอบแบบดิจิทัลมีข้อได้เปรียบที่สำคัญสำหรับการดำเนินการหาปริมาณแบบสัมบูรณ์โดยทำการทดลองทางชีวเคมีแบบคู่ขนานหลายพันครั้งพร้อมกันและแยกกันในกลุ่มขนาดไมครอน แทนที่จะทำในเฟสต่อเนื่องเมื่อเทียบกับไมโครฟลูอิดิกส์แบบเดิม ปฏิกิริยาของชิ้นส่วนสามารถลดปริมาตรของตัวอย่าง เพิ่มประสิทธิภาพของปฏิกิริยา และรวมเข้ากับวิธีการวิเคราะห์อื่นๆ ได้อย่างง่ายดายโดยไม่ต้องใช้ช่อง ปั๊ม วาล์ว และการออกแบบที่กะทัดรัด [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .สองวิธีต่อไปนี้ใช้ในการตรวจวิเคราะห์แบบดิจิทัลเพื่อให้เกิดการแยกตัวของสารละลายที่สม่ำเสมอและแม่นยำ รวมถึงตัวทำปฏิกิริยาและตัวอย่าง เช่น เซลล์ กรดนิวคลีอิก และอนุภาคหรือโมเลกุลอื่นๆ: (1) อิมัลชันหยดที่ใช้ประโยชน์จากความไม่เสถียรของส่วนต่อประสานของเหลว(2) การแบ่งอาร์เรย์ดำเนินการโดยข้อจำกัดทางเรขาคณิตของอุปกรณ์ในวิธีแรก หยดที่มีรีเอเจนต์และตัวอย่างในไมโครแชนเนลสามารถสร้างขึ้นได้โดยวิธีการแบบพาสซีฟ เช่น กระแสร่วม กระแสขวาง การโฟกัสที่การไหล การทำให้เป็นอิมัลชันแบบทีละขั้น อิมัลซิฟิเคชันแบบไมโครแชนเนล และเมมเบรนผ่านแรงเฉือนแบบหนืดและอิมัลซิฟิเคชันด้วยการเปลี่ยนช่องทางการแปลเป็นภาษาท้องถิ่น [143, 145, 146, 148, 149] หรือใช้วิธีการเชิงรุก [150, 151] ซึ่งแนะนำพลังงานเพิ่มเติมผ่านการควบคุมไฟฟ้า แม่เหล็ก ความร้อนและกลไกในแนวทางหลัง ความสม่ำเสมอของปริมาตรของเหลวที่ดีที่สุดในช่องไมโครฟลูอิดิกใช้ร่วมกันโดยการรักษาโครงสร้างเชิงพื้นที่ที่มีขนาดเท่ากัน เช่น ไมโครพิตและอาร์เรย์พื้นผิว [152,153,154]โดยเฉพาะอย่างยิ่ง หยดละอองเป็นส่วนการไหลหลักที่สามารถสร้างและจัดการบนอาร์เรย์อิเล็กโทรดโดยอิงจากไมโครฟลูอิดิกดิจิทัล (DMF)การเปียกด้วยไฟฟ้าของไดอิเล็กตริกเป็นหนึ่งในทฤษฎี DMF ที่มีการศึกษาดีที่สุด เนื่องจากอิเล็กโทรเวตของไดอิเล็กทริกช่วยให้จัดการหยดแต่ละหยดได้อย่างแม่นยำ โดยควบคุมรูปร่างของของเหลวและสัญญาณไฟฟ้าที่ไม่สมมาตรที่ไหลผ่านด้านต่างๆ [141, 144]การดำเนินการหลักกับหยดละอองใน DMF รวมถึงการคัดแยก การแยก และการรวม [151, 155, 156] ซึ่งสามารถนำไปใช้ในด้านการวิเคราะห์ต่างๆ โดยเฉพาะในการตรวจจับระดับโมเลกุล [157, 158, 159]
การตรวจจับกรดนิวคลีอิกแบบดิจิตอลเป็นเทคโนโลยีการวินิจฉัยระดับโมเลกุลรุ่นที่สามตาม PCR ทั่วไปและ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qPCR) ควบคู่ไปกับการจัดลำดับปริมาณงานสูงและการตรวจชิ้นเนื้อของเหลวในช่วงสองทศวรรษที่ผ่านมา กรดนิวคลีอิกดิจิทัลได้พัฒนาขึ้นอย่างรวดเร็วในด้านการวินิจฉัยระดับโมเลกุลของเชื้อโรคที่ติดเชื้อ [160, 161, 162]การหาปริมาณอย่างสมบูรณ์ของการตรวจจับกรดนิวคลีอิกแบบดิจิตอลเริ่มต้นด้วยการบรรจุตัวอย่างและรีเอเจนต์ลงในแต่ละช่องเพื่อให้แน่ใจว่าแต่ละลำดับเป้าหมายมีความเป็นไปได้ที่จะเข้าสู่แต่ละส่วนเท่ากันในทางทฤษฎี แต่ละส่วนสามารถกำหนดลำดับเป้าหมายได้หลายลำดับ หรืออาจไม่มีระบบไมโครปฏิกิริยาอิสระด้วยกลไกการตรวจจับต่างๆ ที่อธิบายข้างต้น ช่องที่มีลำดับเป้าหมายของจุลินทรีย์ที่สร้างสัญญาณเหนือเกณฑ์ที่กำหนดสามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่าหรือโดยเครื่องและถูกระบุว่าเป็นค่าบวก ในขณะที่ช่องอื่นๆ ที่สร้างสัญญาณที่ต่ำกว่าเกณฑ์จะระบุว่าเป็นค่าบวก .ค่าลบ ซึ่งทำให้สัญญาณสำหรับแต่ละส่วนเป็นบูลีนดังนั้น โดยการคำนวณจำนวนช่องที่สร้างขึ้นและอัตราของผลลัพธ์ที่เป็นบวกหลังปฏิกิริยา สำเนาต้นฉบับของตัวอย่างทดสอบสามารถจับคู่ได้โดยใช้สูตรการแจกแจงแบบปัวซองโดยไม่ต้องใช้เส้นโค้งมาตรฐาน ซึ่งจำเป็นสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณเป็นประจำ เช่น เป็น qPCR[163] เมื่อเทียบกับวิธีการวินิจฉัยระดับโมเลกุลแบบดั้งเดิม การตรวจจับกรดนิวคลีอิกแบบดิจิทัลมีระดับการทำงานอัตโนมัติที่สูงกว่า ความเร็วในการวิเคราะห์และความไวที่สูงขึ้น รีเอเจนต์น้อยลง การปนเปื้อนน้อยลง และการออกแบบและการผลิตที่ง่ายกว่าด้วยเหตุผลเหล่านี้ การใช้ชุดตรวจดิจิทัล โดยเฉพาะอย่างยิ่งวิธีการแบบหยดสำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุล การรวมเทคนิคการขยายเสียงและการอ่านสัญญาณ จึงได้รับการศึกษาอย่างดีในระหว่างการระบาดที่สำคัญของ SARS-CoV-2ตัวอย่างเช่น Yin et al.[164] รวมวิธี PCR แบบหยดแบบดิจิทัลและแบบรวดเร็วเพื่อตรวจหายีน ORF1ab, N และ RNase P ใน SARS-CoV-2 ในชิปไมโครฟลูอิดิกโดยเฉพาะอย่างยิ่ง ระบบสามารถระบุสัญญาณเชิงบวกได้ภายใน 115 วินาที ซึ่งเร็วกว่า PCR ทั่วไป ซึ่งบ่งชี้ถึงประสิทธิภาพในการตรวจจับ ณ จุดดูแล (รูปที่ 7a)ดงและคณะ[165] หว่านและคณะ[157] เฉินและคณะ[166] และ Alteri et al.[167] ยังใช้ droplet digital PCR (ddPCR) เพื่อตรวจจับ SARS-CoV-2 ในระบบไมโครฟลูอิดิกด้วยผลลัพธ์ที่น่าประทับใจเพื่อปรับปรุงอัตราการตรวจจับเพิ่มเติม Shen et al.[168] บรรลุการสร้างภาพชิปที่ใช้ ddPCR ในเวลาเพียง 15 วินาทีโดยไม่ต้องใช้เทคนิคการต่อภาพ ซึ่งทำให้กระบวนการเทคโนโลยี ddPCR เร็วขึ้นจากห้องแล็บสู่การใช้งานไม่เพียงแต่ใช้วิธีการขยายความร้อน เช่น PCR แต่ยังใช้วิธีการขยายสัญญาณความร้อนด้วยความร้อนเพื่อทำให้สภาวะของปฏิกิริยาง่ายขึ้นและตอบสนองอย่างรวดเร็วลูและคณะ[71] พัฒนา SlipChip สำหรับการวิเคราะห์หยด สามารถสร้างหยดขนาดต่างๆ ที่ความหนาแน่นสูงในขั้นตอนเดียว และหาปริมาณกรดนิวคลีอิก SARS-CoV-2 โดยใช้หลอดไฟดิจิตอล (รูปที่ 7b)ในฐานะที่เป็นเทคโนโลยีที่มีการพัฒนาอย่างรวดเร็ว CRISPR ยังสามารถมีบทบาทสำคัญในการตรวจจับกรดนิวคลีอิกแบบดิจิทัลผ่านการถ่ายภาพด้วยสีที่สะดวกโดยไม่จำเป็นต้องเพิ่มคราบกรดนิวคลีอิกเพิ่มเติมแอคเคอร์แมนและคณะพัฒนาปฏิกิริยาเมทริกซ์แบบผสมผสานสำหรับการประเมินกรดนิวคลีอิกแบบมัลติเพล็กซ์[158] ตรวจพบไวรัสที่เกี่ยวข้องกับมนุษย์ 169 ตัว ซึ่งรวมถึง SARS-CoV-2 ในหยดที่มีสารตรวจจับกรดนิวคลีอิกที่มี CRISPR-Cas13 เป็นพื้นฐานในการทดสอบแบบไมโครเวลล์ (รูปที่ 7c)นอกจากนี้ยังสามารถใช้เครื่องขยายสัญญาณอุณหภูมิความร้อนและเทคโนโลยี CRISPR ในระบบเดียวกันเพื่อรวมข้อดีของทั้งสองอย่างเข้าด้วยกันปาร์คและคณะ[169] การทดสอบดิจิตอล CRISPR/Cas12a ได้รับการพัฒนาในชิปไมโครฟลูอิดิกเชิงพาณิชย์สำหรับการตรวจจับ SARS-CoV-2 ที่สกัดและฆ่าด้วยความร้อนโดยใช้ RT-RPA แบบขั้นตอนเดียวที่มีการตรวจจับสัญญาณไปยังพื้นหลังที่สั้นกว่าและสูงกว่า อัตราส่วนเวลาช่วงไดนามิกที่กว้างขึ้นและความไวที่ดีขึ้น (รูปที่ 7d)คำอธิบายบางส่วนของตัวอย่างเหล่านี้แสดงไว้ในตารางที่ 3
แพลตฟอร์มดิจิทัลทั่วไปสำหรับการตรวจจับกรดนิวคลีอิกa เวิร์กโฟลว์ PCR ดิจิทัลอย่างรวดเร็วประกอบด้วยสี่ขั้นตอนหลัก: การเตรียมตัวอย่าง การกระจายของส่วนผสมของปฏิกิริยา กระบวนการขยายเสียง และการหาปริมาณเป้าหมาย (ดัดแปลงจาก [164])b แผนผังแสดงการวิเคราะห์หยด SlipChip สำหรับการเกิดหยดที่ความหนาแน่นสูง (ดัดแปลงมาจาก [71])c แผนภาพเวิร์กโฟลว์ CARMEN-Cas13 (ดัดแปลงมาจาก [158])d ภาพรวมของการตรวจหาไวรัสดิจิทัลขั้นสูงด้วย CRISPR/Cas ในหม้อเดียว (ดัดแปลงจาก [169])น้ำในน้ำมัน W/O, polydimethylsiloxane PDMS, ปฏิกิริยาลูกโซ่ PCR โพลีเมอเรส, การรวบรวมข้อมูล DAQ, อนุพันธ์อินทิกรัลเชิงสัดส่วน PID, ปฏิกิริยาเมทริกซ์ของ CARMEN สำหรับการประเมินกรดนิวคลีอิกมัลติเพล็กซ์, SARS-CoV-2, โรคระบบทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง, coronavirus 2 , การขยาย RT ของ reverse transcriptase recombinase polymerase-RPA, สัญญาณ S/B ในพื้นหลัง